Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans jest często wykorzystywany jako model w badaniach wczesnych procesów rozwojowych. Przezroczystość embrionów, dostępne zasoby genetyczne oraz wzglatywna łatwość transformacji sprawiają, że C. elegans jest doskonałym modelem wczesnej embriogenezy. Mikroskopia konfokalna oparta na laserze oraz znaczniki fluorescencyjne pozwalają badaczom śledzić specyficzne struktury komórkowe i białka w rozwijającym się embrionie. Przykładowo, można śledzić konkretne organelle, takie jak lizosomy lub mitochondria, przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Barwniki te mogą zostać wprowadzone do wczesnego embrionu poprzez mikroiniekcję do gonady dorosłego osobnika. Ponadto lokalizację specyficznych białek można śledzić za pomocą fluorescencyjnych znaczników białkowych. W niniejszej pracy przedstawiono przykłady demonstrujące zastosowanie fluorescencyjnego barwnika lizosomalnego, a także histonów i białek ubikwityny z fluorescencyjnymi znacznikami. Znakowany histon służy do wizualizacji DNA, a tym samym do identyfikacji fazy cyklu komórkowego. Ubikwityna z tagiem GFP ujawnia dynamikę ubikwitynowanych pęcherzyków we wczesnym embrionie. Obserwacje znakowanych lizosomów oraz GFP::ubikwityny mogą być wykorzystane do ustalenia, czy występuje kolokalizacja między pęcherzykami ubikwitynowanymi a lizosomami. Przedstawiono technikę mikroiniekcji barwnika lizosomalnego. Techniki tworzenia szczepów transgenicznych zostały opisane w innych opracowaniach (1, 2). W celu obrazowania embriony są wycinane z dorosłych hermafrodytycznych nicieni i montowane na 2% podkładach agarozowych, po czym przeprowadzana jest mikroskopia time-lapse przy użyciu standardowego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego mikroskopu z dyskiem rotującym (spinning disk). Metodyka ta umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację wczesnej embriogenezy.

Protokół

1. Hodowle nicieni

1. Pozyskaj odpowiedni szczep C. elegans z Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) lub od współpracownika.
2. Hoduj nicienie na płytkach z agarem NGM zaszczepionych trawnikiem bakteryjnym OP50 (3). W przypadku analizy szczepów GFP zaleca się wzrost w temperaturze 25°C.
3. Dzień przed eksperymentem mikroskopowym przenieś co najmniej 40 larw w stadium L4 na zaszczepione płytki i inkubuj je w temperaturze 25°C przez noc. Nicienie te będą w stadium młodych dorosłych w momencie przeprowadzenia eksperymentu.

2. Iniekcje

Jeśli pożądana jest wizualizacja struktur takich jak lizosomy lub mitochondria, osobnikom dorosłym można wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny przed przystąpieniem do obrazowania.

1. Przygotuj wysuszone podkładki agarozowe do iniekcji. (można to zrobić od jednego do wielu dni wcześniej)
   1. Przygotuj stopioną 2% agarozę w wodzie. Za pomocą pipety Pasteura nanieś 2 krople na szkiełko nakrywowe o wymiarach 2X54 mm. Połóż drugie szkiełko nakrywowe na krzyż na kropli. Aby uzyskać odpowiednią grubość, naciśnij górne szkiełko, aż średnica podkładki wyniesie około 1,5 cm. Pozostaw na 5-10 minut.
   2. Usuń górne szkiełko nakrywowe. Odwodnij podkładkę agarozową, umieszczając ją w piecu w temperaturze 80°C przez 1 godzinę lub pozostawiając na blacie na noc.
2. Przygotuj roztwór Mitotrackera lub Lysotrackera.
   1. Rozcieńcz czynnik fluorescencyjny w buforze do jaj (Egg Buffer). Zazwyczaj stosujemy rozcieńczenie Mitotrackera lub Lysotrackera w stosunku 1:10.
   2. Igła do iniekcji jest wykonana z kapilary szklanej o średnicy zewnętrznej (OD) 1,2. Wyciągnij igłę do iniekcji za pomocą wyciągacza igieł.
   3. Użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby napełnić igłę od tyłu rozcieńczonym barwnikiem.
   4. Umieść igłę w komorze wilgotnościowej, chronionej przed światłem, do momentu użycia.
3. Przed iniekcją: Konfiguracja mikroskopu i igły.
   1. Zamocuj igłę do iniekcji w aparacie do iniekcji. Nasz aparat to mikromanipulator z bezpośrednim napędem firmy Narishige, zamontowany na stoliku odwróconego mikroskopu Nikon TE200 wyposażonego w system obrazowania DIC.
   2. Połącz igłę z rurką o średnicy wewnętrznej (ID) 1,2 mm, która jest podłączona do regulatora ciśnienia. Jako zewnętrzne źródło ciśnienia można zastosować sprężone powietrze lub azot. Ustaw regulator na 20-25 psi.
   3. Nanieś 2 krople ciężkiego oleju mineralnego (oleju parafinowego) na podkładkę do iniekcji.
   4. Umieść podkładkę do iniekcji na mikroskopie i opuść igłę do oleju. Sprawdź, czy ciecz swobodnie wypływa z igły po przyłożeniu ciśnienia. Przyłóż ciśnienie wtryskowe i zaobserwuj, czy ciecz wypływa z igły. Jeśli nie, należy delikatnie złamać końcówkę igły. Można to zrobić, delikatnie wbijając końcówkę w mały kawałek rozbitego szkiełka nakrywowego umieszczonego na podkładce do iniekcji. Gdy ciecz zacznie wypływać, przejdź do następnego kroku.
4. Iniekcja.
   1. Około 1 godziny przed obserwacją embrionów przenieś młode dorosłe nicienie do kropli oleju na podkładce do iniekcji. Wykonaj ten transfer za pomocą mikroskopu stereotypowego. Do przenoszenia nicieni używaj platynowego drutu z zaostrzoną końcówką.
   2. Ułóż od 3 do 10 nicieni tak, aby leżały bezpośrednio na podkładce. Dla ułatwienia iniekcji najlepiej ustawić nicienie równolegle do siebie, w odległości nieco mniejszej niż długość jednego nicienia. Po umieszczeniu nicieni na podkładce ważne jest, aby pracować szybko i zakończyć proces iniekcji, zanim nicienie zginą z powodu odwodnienia.
   3. Umieść szkiełko nakrywowe z nicieniami na stoliku mikroskopu do iniekcji. Ustaw ostrość na część centralną (rachis) dystalnej części przewodu gonadnego. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę igły do tej samej płaszczyzny ogniskowania. Przesuń stolik poziomo tak, aby igła przebiła nicienia. Gdy końcówka igły znajdzie się wewnątrz rachis, przyłóż ciśnienie i pozwól, aby gonada wypełniła się mieszaniną barwnika. Wykonaj iniekcję w oba ramiona gonady u wszystkich nicieni na podkładce.
   4. Po iniekcji użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby dostarczyć nicieniom około 0,5 ml buforu do jaj (Egg Buffer). Zapobiegnie to ich śmierci z odwodnienia i pozwoli na regenerację po procedurze iniekcji.
   5. Pozostaw nicienie do regeneracji na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej, chronionej przed światłem.

3. Podkładka agarozowa do obserwacji zarodków

1. Przygotować stopioną 2% agarozę w buforze jajecznym (Egg Buffer).
2. Za pomocą pipety Pasteura nanieść 3 krople stopionej agarozy na czyste szkiełko mikroskopowe.
3. Umieścić szkiełko pomiędzy dwoma innymi szkiełkami, które są oklejone jedną warstwą taśmy opisowej. Służą one jako dystansory, które zapewnią odpowiednią grubość podkładki agarowej.
4. Położyć drugie czyste szkiełko mikroskopowe prostopadle na kroplach agarozy. Docisnąć, aż górne szkiełko oprze się na taśmie szkiełek prowadzących.
5. Bezpośrednio przed przystąpieniem do montażu embrionów do obserwacji, zdjąć górne szkiełko.

4. Montaż zarodków do obserwacji

1. Jeśli nicienie nie zostały poddane iniekcji, należy wykonać dwa następne kroki. W przeciwnym razie należy je pominąć.
   1. Wybierz młode dorosłe nicienie z płytki przygotowanej dzień wcześniej. Wewnątrz młodych osobników powinny być widoczne embriony.
   2. Przenieś 5-20 nicieni na nieobsianą płytkę NGM. Pozostaw nicienie na kilka minut na nieobsianej płytce, aby pozbyły się większości przywierających do nich bakterii.
2. Pozyskiwanie młodych embrionów z dorosłych nicieni
   1. Nanieś kroplę 5-20 μl buforu do jaj (Egg Buffer) na środek szkiełka podstawowego o wymiarach 18 mm² (preferowana grubość szkiełka to 1,5).
   2. Przenieś nicienie z nieobsianej płytki lub podkładki do iniekcji do kropli buforu do jaj.
   3. Rozetnij nicienie za pomocą igły hipodermicznej o rozmiarze 26 gauge. Rozetnij nicienia w pobliżu wulwy. Powinno dojść do wydostania się embrionów z organizmu nicienia.
3. Montowanie na szkiełku mikroskopowym
   1. Odwróć szkiełko mikroskopowe z przygotowaną podkładką agarozową i opuść je na szkiełko nakrywkę z embrionami.
   2. W przypadku konieczności wykonania długotrwałego time-lapse, użyj wazeliny do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywki, aby zapobiec wysychaniu.

5. Mikroskopia

1. Wyszukanie odpowiednich embrionów.
   1. Umieść preparat na stoliku mikroskopu. Przeskanuj go obiektywem 10X, aby zlokalizować embriony.
   2. Aby znaleźć embriony we wczesnym stadium, szukaj tych, które są w procesie kończenia mejozy macierzystej. Embriony meiotyczne można odróżnić od późniejszych stadiów po tym, że nie uległy one jeszcze skróceniu. (Po zakończeniu mejozy w embrionach widoczna jest znaczna przerwa między błoną komórkową a skorupką jaja na końcu przednim).
   3. Po zidentyfikowaniu embrionu w odpowiednim stadium, przejdź na obiektyw o większym powiększeniu w celu rejestracji embriogenezy.
2. Obrazowanie
   1. W tym przykładzie obrazujemy embriony wykazujące ekspresję białek znakowanych mCherry::H2B oraz GFP::Ub. Używamy konwencjonalnego skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM70.
   2. Obrazy są zbierane przy użyciu obiektywu 63X 1.4NA. Lasery 48 i 5 są wykorzystywane przy minimalnej mocy lasera i maksymalnym wzmocnieniu. Seria obrazów Z-stack jest zbierana co 10-15 sekund. W zależności od stopnia fotoblaknięcia zbiera się od 30 do 60 punktów czasowych. Obrazy Z-stack są łączone w obraz projekcji maksymalnej do końcowego filmu time-lapse.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Od zapłodnienia do pierwszej mitozy w C. elegans.

Rycina 2. Procedura mikrowstrzykiwania.

Wideo dodatkowe 1. Film poklatkowy z obrazowaniem GFP:ubiquitin oraz Lysotracker Blue w embrionie meiotycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.

Dyskusja

Po fuzji z plemnikiem zygota przechodzi szereg dynamicznych zdarzeń. Procesy te przekształcają oocyt z komórki relatywnie statycznej w szybko rozwijający się embrion. U wielu organizmów reorganizacje cytoplazmatyczne są kluczowe dla ustanowienia polarności embrionalnej oraz aktywacji komórki jajowej. Embrion C. elegans stwarza doskonałą okazję do obserwacji tych wczesnych etapów aktywacji jaja i embriogenezy. Embrion jest przezroczysty, a wczesne zdarzenia rozwojowe następują stosunkowo szybko po zapłodnieniu. Badacze C. elegans stworzyli wiele użytecznych szczepów transgenicznych wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie, które biorą udział we wczesnym rozwoju. Wykorzystanie tych szczepów wraz z RNAi lub mutantami zapewnia potężny system do analizy szlaków molekularnych leżących u podstaw rozwoju organizmu wielokomórkowego (5, 6, 7, 8). Niniejszy artykuł wideo przedstawia praktyczne podejście do wykorzystania tych narzędzi i technik w celu rejestracji zdarzeń podczas wczesnej embriogenezy u C. elegans.

Dojrzały oocyt C. elegans jest zatrzymany w profazie mejozy I i zostaje zapłodniony w spermatece dorosłego hermafrodyty. Po zapłodnieniu oocyt przechodzi przez pozostałe etapy mejozy I i II. Etapy te można obserwować, wykorzystując histonę H2B znakowaną fluorescencyjnie (5). Podczas kończenia mejozy macierzystej DNA plemnika pozostaje skondensowane (patrz Rysunek 1). Po zakończeniu mejozy DNA macierzyste i ojcowskie ulegają dekondensacji i formują się dwa prądzierze. Prądzierz macierzysty migruje w stronę prądzierza ojcowskiego, a następnie łączą się one w pobliżu centrum embrionu. Po spotkaniu prądzierzy szybko następuje mitoza. Wszystkie te zdarzenia zachodzą w czasie krótszym niż godzina. W związku z tym mikroskopia poklatkowa tej sekwencji zdarzeń może zostać łatwo przeprowadzona. Wykonanie tej techniki wymaga pewnej biegłości w hodowli nicieni oraz podstawowych umiejętności mikroskopowych, a także dostępu do mikroskopu konfokalnego.

Przykład przedstawiony w niniejszej pracy wykorzystuje transgeniczny szczep C. elegans, który wykazuje ekspresję dwóch białek fluorescencyjnych: GFP::ubiquitin oraz mCherry::H2B. Do obserwacji dynamicznej lokalizacji tych dwóch białek wykorzystano konfokalny skaningowy mikroskop laserowy. Ponadto wykazano, że wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanego Lysotracker pozwala na śledzenie losów lizosomów w zarodku po zapłodnieniu. Wstrzyknięcie znakowanego znacznika może być również zastosowane w celu wizualizacji mitochondriów lub lokalnych stężeń wapnia (9). Teoretycznie protokół wstrzykiwania mógłby zostać wykorzystany do obserwacji dowolnego rodzaju fluorescencyjnie znakowanej cząsteczki w zarodku. Mogą to być m.in. znakowane małe cząsteczki, białka, lipidy itp. W niektórych przypadkach faktyczne wstrzykiwanie znaczników może nie być konieczne, ponieważ nicienie chętnie pobierają niektóre barwniki, takie jak mitotracker (10). Niemniej jednak, po przetestowaniu zarówno metody namaczania, jak i wstrzykiwania lysotracker, stwierdzono, że wstrzykiwanie daje znacznie lepsze wyniki w wizualizacji w zarodkach.

Uwagi techniczne:

Wyzwania techniczne związane z tą procedurą obejmują technikę mikroiniekcji, a także trudności w obrazowaniu embrionów we wczesnych stadiach rozwoju. W odniesieniu do mikroiniekcji, kluczowe dla sukcesu zabiegu jest uzyskanie odpowiedniej grubości podkładki z agarozy. Jeśli podkładka będzie zbyt gruba, nicienie szybko wyschną i zginą. Jeśli natomiast podkładka będzie zbyt cienka, nicienie nie będą się do niej przylegać podczas procesu iniekcji.

Wczesne embriony mogą być wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak temperatura i skład buforu. Embriony typu dzikiego powinny rozpocząć dekondensację DNA plemnika oraz migrację pronukleusów w ciągu około minuty od zakończenia mejozy II (4). W ciągu 20 minut powinna rozpocząć się pierwsza cytokineza. Jeśli embriony zostaną poddane działaniu bardzo wysokiej intensywności lasera, przegrzeją się lub zostaną zmiażdżone podczas montażu, proces ten może zostać zakłócony. W takich przypadkach rozwój embrionów zostanie zatrzymany. Jeśli tak się stanie, należy powtórzyć eksperyment, zmniejszając moc lasera lub stosując grubszą podkładkę agarozową.

C. elegans nie wydzielają skorupki jaja aż do czasu krótkiego po zapłodnieniu. W krótkim odstępie czasu między zapłodnieniem a wydzieleniem skorupki jaja zarodki nie są zdolne do przeżycia poza organizmem matki (11). Niektóre laboratoria unikają tego problemu, obrazując zarodki in utero (5, 12). Obrazowanie in utero oferuje pewne zalety, takie jak możliwość uchwycenia zdarzeń występujących w trakcie lub tuż po zapłodnieniu. Technika ta wymaga jednak zastosowania systemu mikroskopowego umożliwiającego obrazowanie głębokich tkanek. Szczególnie odpowiednie do tego celu są systemy dwufotonowe lub wielofotonowe (13, 14). Przy użyciu konwencjonalnego konfokalnego mikroskopu laserowo-skanującego lub z dyskiem wirującym najlepsze obrazy uzyskuje się z zarodków wyciętych z dorosłego nicienia, zgodnie z opisaną tutaj procedurą.

Uwagi dotyczące systemu obrazowania:

Rodzaj zastosowanego systemu obrazowania konfokalnego zależy od potrzeb użytkownika. Generalnie systemy skanowania laserowego są zalecane, gdy celem jest uzyskanie obrazów o najwyższej możliwej rozdzielczości. Z kolei systemy z dyskiem obrotowym (spinning disk) lepiej nadają się do obrazowania procesów o wysokiej dynamice, ponieważ akwizycja obrazu jest stosunkowo szybka, a fotobleaching i fototoksyczność są zredukowane.

Konkretne parametry obrazowania będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego i zastosowanego systemu obrazowania konfokalnego. W obrazowaniu wielowymiarowym należy uwzględnić liczbę kanałów, płaszczyzn ogniskowania i punktów czasowych poddawanych akwizycji. Ze względu na ograniczający wpływ fotobleachingu i fototoksyczności, w każdym eksperymencie można pozyskać ograniczoną liczbę obrazów. Zatem w przypadku decyzji o zwiększeniu liczby rejestrowanych kanałów, prawdopodobnie konieczne będzie zmniejszenie liczby płaszczyzn ogniskowania i/lub punktów czasowych i odwrotnie. Całkowita liczba obrazów, które można pozyskać, będzie zależeć od intensywności obrazowanego fluoroforu, a także od czułości używanego mikroskopu konfokalnego. Bardziej intensywne fluorofory i czulsze urządzenia wymagają krótszych czasów ekspozycji, co skutkuje mniejszym fotobleachingiem i fototoksycznością.

Dostępnych jest wiele systemów obrazowania. Przedstawimy szczegółowe informacje o systemach wykorzystywanych w naszych własnych laboratoriach. Do obrazowania embrionów nicieni za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem wirującym używamy odwróconego mikroskopu Nikon TE2000U wyposażonego w obiektyw 60X/1.4 N.A. Plan Apo. Mikroskop jest połączony z jednostką dysku wirującego Yokogawa CSU10, kamerą EM CCD Hamamatsu C9100-13 oraz modułem łączenia laserów Spectral Applied Research LMM5 zawierającym cztery lasery półprzewodnikowe o długości fali 405, 491, 561 i 655 nm. Korzystając z tego systemu, możemy rejestrować jeden lub dwa kanały, od sześciu do dwunastu płaszczyzn ogniskowania oraz od 25 do 50 punktów czasowych (w odstępach od 30 do 60 sekund). Typowy czas ekspozycji wynosi od 100 do 200 milisekund.

Do obrazowania zarodków za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej używamy systemu Zeiss LSM700 wyposażonego w 2 kanały i cztery lasery półprzewodnikowe (405, 488, 555 i 635 nm). System ten jest połączony z odwróconym mikroskopem Zeiss Axio Observer z obiektywem Plan-Apo 63X/1.4NA wykorzystywanym do obrazowania zarodków. System wykorzystuje oprogramowanie Zeiss ZEN do akwizycji obrazów, które zapewnia również ograniczone możliwości przetwarzania i analizy obrazu. Podczas obrazowania z użyciem dwóch fluorochromów zazwyczaj rejestrujemy 1-5 płaszczyzn ogniskowych (w odstępach ok. 0,5 μm) i zbieramy stosy Z (Z stack) co 15 sekund. Akwizycję kontynuujemy do momentu wystąpienia znacznego fotowybielania. Aby stworzyć końcowy film poklatkowy, obrazy ze stosów Z są konsolidowane za pomocą narzędzia maksymalnej projekcji (maximum projection) w oprogramowaniu ZEN. Filmy są eksportowane z oprogramowania jako pliki avi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do jaj			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM octanu Mg, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Kapilara do mikroiniekcji	Harvard Apparatus	GC120F-10
Wyciągacz igieł	Kopf Instruments	Model 700C
Aparat do mikroiniekcji	Tritech Research, Inc.	regulator mikroiniekcji MINJ-1