Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Podsumowanie

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby ^1,2,3,4.

Streszczenie

Kanały GABA_A występują we wszystkich neuronach i znajdują się zarówno w synapsach, jak i poza nimi, gdzie generują odpowiednio prądy fazowe i toniczne ^4,5,6,7. Kanał GABA_A jest pentamerycznym kanałem chlorkowym sterowanym przez GABA. Podjednostki kanału dzielą się na 8 rodzin (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π i ρ). Funkcjonalny kanał tworzą dwie podjednostki alfa, dwie beta oraz jedna podjednostka 3^{rd 8}. Poprzez połączenie badań specyficznych dla podtypów cząsteczek pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA z badaniami obejmującymi wszystkie populacje kanałów GABA_A w neuronie, możliwe staje się zrozumienie podstawowego mechanizmu inhibicji neuronalnej oraz sposobu, w jaki jest ona modulowana przez środki farmakologiczne.

Wykorzystujemy technikę patch-clamp ^9,10 do badania właściwości funkcjonalnych kanałów GABA_A w żywych neuronach w skrawkach hipokampa mózgu oraz do rejestracji prądów pojedynczego kanału i prądów całokomórkowych. Badamy ponadto, w jaki sposób na kanały wpływają różne stężenia GABA, inne leki oraz czynniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. Szczegółowy opis teoretyczny i praktyczny metody patch-clamp znajduje się w publikacji The Single-Channel Recordings pod redakcją B. Sakmana i E. Nehera ¹⁰.

Protokół

1. Przygotowanie skrawków mózgu:

Eksperymenty przeprowadzono na skrawkach hipokampa pobranych od szczurów Wistar w wieku od 16 do 22 dni po urodzeniu.

1. Zwierzęta są uśmiercane poprzez dekapitację zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi i zatwierdzonymi protokołami opieki nad zwierzętami.
2. Szybko wyjmij mózg za pomocą szpatułki i przetnij go wzdłuż linii środkowej skalpelem (nr 24). Umieść każdą półkulę na papierze filtracyjnym Whatmana stroną przeciętą do papieru.
3. Nałóż kroplę superglue na dysk do preparatów i umieść na niej półkulę stroną przeciętą do dołu. Umieść dysk z preparatem w komorze tnącej wibratomu wypełnionej lodowatym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF, patrz poniżej w punkcie 3.1).
4. Ustaw grubość skrawka na 400 μM i rozpocznij krojenie mózgu. Przed dotarciem do hipokampa należy odciąć około 2 mm tkanki mózgowej.
5. Skrawki hipokampa przenosi się do szklanej szalki Petriego wypełnionej ACSF. Szalkę umieszcza się na czarnym tle (np. czarnym papierze), aby ułatwić wizualizację hipokampów. Wyizoluj hipokamp z otaczającej go tkanki za pomocą ostrych ostrzy chirurgicznych. Należy uważać, aby nie uciskać ani nie rozciągać tkanki.
6. Skrawki inkubuje się następnie w roztworze ACSF w temperaturze 37.0 °C przez 1h, a następnie przechowuje w temperaturze pokojowej do czasu przeprowadzenia eksperymentów. Podczas godzinnej inkubacji tkanka regeneruje się po uszkodzeniach powstałych w procesie krojenia.

2. Przygotowanie pipet do patch-clampu:

1. Pipety są wykonane z kapilar ze szkła borokrzemianowego.
2. Pipety do patch-clampu są wyciągane przy użyciu automatycznych lub ręcznych wyciągaczy do pipet, co pozwala uzyskać oporność pipet wynoszącą 2 - 4 MΩ dla rejestracji z całej komórki (whole-cell) lub 8 – 20 MΩ dla rejestracji pojedynczych kanałów, gdy są one wypełnione odpowiednim roztworem do pipet, a roztworem kąpieli jest ACSF (patrz poniżej, 3.1).
3. Pipety stosowane do rejestracji pojedynczych kanałów są polerowane za pomocą mikrokuźni, w której ciepło z przetopionego szkła osadzonego na platynowym drucie wygładza powierzchnię. Do utworzenia kropli szkła na drucie wykorzystuje się to samo szkło borokrzemianowe, z którego wykonane są pipety do patch-clampu. W naszym doświadczeniu polerowanie pipet w ten sposób pozwala na utworzenie bardziej stabilnych uszczelnień o wyższej oporności w porównaniu do pipet polerowanych ciepłem z niepowleczonego drutu lub za pomocą etapu polerowania w wyciągaczu automatycznym. Końcowy rozmiar pipet mieści się w zakresie od 8 do 20 MΩ. Pipety stosowane w rejestracjach whole-cell nie są polerowane.

3. Roztwory użyte w eksperymentach:

Do rejestracji pojedynczych kanałów oraz rejestracji z całej komórki stosuje się specyficzne roztwory.

1. ACSF zawiera w mM: 124 NaCl, 26 NaHCO₃, 3 KCl, 1.3 MgSO₄, 2.5 Na₂HPO₄, 2.5 CaCl₂, 10 glukozy przy pH 7.2 - 7.4 po napowietrzaniu mieszaniną 95% O₂ i 5% CO₂. ACSF jest czasami uzupełniany o inne składniki odżywcze, np. mleczan ¹¹.
2. Rejestracje pojedynczych kanałów: roztwór kąpielowy to ACSF lub w mM: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 1.8 CaCl₂ oraz 10 TES (kwas N-tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowy) pH 7.25 oraz inne leki, które mogą być potrzebne do konkretnych eksperymentów. roztwór pipety dla konfiguracji cell-attached i inside-out w mM: 140 Choline Cl, 5 NaCl, 1 KCl, 1 MgCl₂, 1.8 CaCl₂, 10 TES pH 7.25, 200 μM saklofeny (antagonista GABAB) i 0 - 1 μM GABA. Dla konfiguracji outside-out w mM: 140 NaCl lub Choline Cl, 0.3 KCl, 2 MgCl₂, 0.5 CaCl₂, 5 EGTA, 10 TES pH 7.2 - 7.4.
3. Rejestracje whole-cell w konfiguracji voltage-clamp: roztwór kąpielowy: skrawki są perfundowane (2 - 3 ml/min) ACSF zawierającym dodatkowo kwas kynurenowy (3 mM) oraz inne leki, które mogą być potrzebne do konkretnych eksperymentów. roztwór pipety zawiera w mM: 140 CsCl, 1 CaCl₂, 3 EGTA, 0.5 KCl, 1 MgCl₂, 2 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, 5 bromku QX-314, 10 TES pH 7.25 ustawione za pomocą CsOH.

4. Formowanie uszczelnienia gigaomowego (GΩ) do eksperymentów patch-clamp:

Przekroje hipokampa mózgu (Rys. 1A) są utrzymywane na dnie komory rejestracyjnej za pomocą nylonowych nici na platynowym drucie w kształcie litery U. W celu wizualizacji organizacji tkanki, np. obszarów CA1 i CA3 oraz zakrętu zębatego w przekrojach hipokampa lub konkretnych komórek, niezbędny jest mikroskop. Większość laboratoriów korzysta z mikroskopu biologicznego z obiektywami o powiększeniach od 10X do 60X, co pozwala na identyfikację obszarów lub konkretnych komórek w tkance. Jednak do patchowania przekrojów można użyć nawet mikroskopu stereoskopowego, identyfikując wizualnie obszar do patchowania, ale nie konkretną komórkę. Ten rodzaj patchowania nazywa się „blind patching” (patchowanie ślepe). W obu przypadkach ostatecznie patchowana jest pojedyncza komórka w konkretnym obszarze. Odsetek sukcesu dla obu metod jest podobny. Chociaż ciała komórek głównych w hipokampie są zorganizowane w wysoko strukturalne warstwy (np. stratum pyramidale CA3/CA1, widoczne jako jasne pasma w przekroju hipokampa), w obrębie wszystkich podpól i warstw hipokampa rozproszone są ciała komórek interneuronów hamujących, które stanowią około 10% całkowitej populacji neuronalnej ¹². Sporadycznie patchowany interneuron lub komórka glejowa w warstwie komórek ziarnistych lub piramidowych może zostać odróżniony od komórek głównych na podstawie odmiennych właściwości elektrycznych tych komórek (patrz The Hippocampus Book ¹³).

1. Tworzenie uszczelnienia GΩ. Podczas tej procedury pipeta szklana zostaje ściśle przyłączona do błony komórkowej, co w różnych konfiguracjach patch-clamp (patrz niżej, pkt 4 i 5) pozwala na pomiar aktywności kanałów aktywowanych przez GABA, które znajdują się w błonie komórkowej.
   Umieść pipetę w uchwycie i dokręć nasadkę mocującą pipetę. Ustawienia wzmacniacza Axoclamp 200B to: V-clamp, Gain 2, Filter 2 kHz, potencjał utrzymujący wynosi 0 mV; eksperyment przeprowadzamy za pomocą komputera z wykorzystaniem oprogramowania PClamp.
2. Wdmuchnij powietrze do ustnika przymocowanego do rurki łączącej się z uchwytem pipety i zamknij zawór między ustnikiem a rurką. Tworzy to nadciśnienie w pipecie. Nadciśnienie w pipecie pełni dwie funkcje; po pierwsze, z pipety wydostaje się strumień cieczy, który po zanurzeniu pipety w roztworze kąpieli pomaga utrzymać czystość jej końcówki. Po drugie, zastosowanie delikatnego ssania do błony komórkowej za pomocą pipety patch-clamp jest kluczowym elementem tworzenia wysokiej jakości uszczelnienia o wysokiej rezystancji. Uszczelnienie często można utworzyć po prostu poprzez otwarcie zaworu sterującego ciśnieniem w pipecie. Z tego powodu należy upewnić się, że nie ma wycieków powietrza. Wycieki można łatwo sprawdzić, zanurzając uchwyt z pipetą w zlewce z wodą i wdmuchując powietrze do ustnika. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, oznacza to, że dany element nie jest wystarczająco szczelny.
3. Opuść pipetę do roztworu kąpieli. Na ekranie komputera, na którym mierzona jest rezystancja pipety, pojawi się impuls prostokątny generowany przez pociąg impulsów 5 mV oraz liczba informująca o rezystancji pipety. Mniejsza liczba oznacza większe otwory w końcówce pipety, czyli większe pipety. Ustaw offset pipety na 0.
4. Uszczelnianie do błony komórkowej. Zidentyfikuj obszar lub komórkę, którą zamierzasz poddać procedurze patch-clamp, czyli w której utworzysz uszczelnienie. W skrawku mózgu można zidentyfikować ziarniste komórki zakrętu zębatego lub obszary ciał komórek piramidowych CA1 i CA3 hipokampa jako jasne pasma (patrz Rys. 1A), korzystając z powiększenia 10X w mikroskopie, lub można zidentyfikować poszczególne powierzchniowe neurony piramidowe przy powiększeniu 60X.
   1. Ustaw ostrość pipety tak, aby patrząc przez okulary mikroskopu, widzieć zarówno wybrany obszar/komórkę, jak i pipetę.
   2. Za pomocą ustawień manipulatora do ruchów grubych umieść pipetę nad środkiem obszaru/komórki i opuszczaj ją, aż znajdzie się tuż nad tkanką, ale jej nie dotyka.
   3. Bardzo delikatnie opuść pipetę na środek obszaru/komórki, korzystając z ustawień ruchów precyzyjnych manipulatora, jednocześnie obserwując ekran komputera i śledząc rezystancję pipety. Przesuwaj pipetę w dół, aż zauważysz wzrost rezystancji pipety (wyższa wartość).
   4. Teraz ostrożnie zwolnij nadciśnienie w pipecie poprzez otwarcie zaworu. Powoduje to powstanie delikatnego ssania i często automatycznie tworzy się giga-uszczelnienie (uszczelnienie o wysokiej rezystancji, GΩ). Jeśli tak się nie stanie, zastosuj ssanie przy ustniku, w którym wcześniej wytwarzano nadciśnienie, aby utworzył się Giga-Seal.
   5. Uzyskałeś teraz tzw. konfigurację patch-clamp Cell-Attached (patrz Rys. 1B). Dostrój szybką i wolną kompensację pojemności, aby wyeliminować sygnały przejściowe pochodzące z pipety i uchwytu pipety. Na ekranie komputera zobaczysz teraz płaski przebieg prądu. Im wyższa wartość uszczelnienia GΩ, tym lepszy stosunek sygnału do szumu uzyskasz w pomiarach pojedynczych kanałów.

Czasami korzystne może być wykonanie patch-clampu wewnątrz skrawka hipokampa. W niektórych przypadkach komórki mogą być w lepszej kondycji, gdy nie znajdują się na powierzchni, ponieważ są wtedy lepiej chronione. Ponadto, w przypadku badania wpływu środowiska zewnątrzkomórkowego na funkcje komórkowe, np. wpływu stężeń zewnątrzkomórkowej GABA na generowanie prądu tonicznego w neuronach, patchowanie wewnątrz tkanki może być zaletą. Procedura patchowania jest taka sama, jak opisano powyżej, z wyjątkiem tego, że nie zwalnia się nadciśnienia w pipecie, dopóki jej końcówka nie znajdzie się wewnątrz skrawka.

5. Ustanowienie konfiguracji whole-cell i rejestracja prądów whole-cell:

1. W konfiguracji cell-attached zmień potencjał pipety na -60 mV lub wartość zbliżoną do potencjału spoczynkowego błony danej komórki.
2. Przyложи ssanie do pipety za pomocą rurki podłączonej do uchwytu pipety, jednocześnie obserwując ekran komputera, aby odnotować zmianę rezystancji oraz przejście pojemności, które pojawią się po przebiciu się do wnętrza komórki. W tym momencie przechodzisz w tzw. konfigurację Whole-Cell lub tryb Whole-Cell (Rys. 1B).
   Rezystancja błony komórkowej różni się w zależności od typu komórki i zależy od przewodnictwa kanałów w błonie oraz liczby kanałów otwartych. Pojemność błony komórkowej zmienia się wraz z rozmiarem komórki. Ssanie powinno być początkowo delikatne, ale jeśli przebicie się do komórki jest utrudnione, można zastosować większą siłę. Można również stosować impulsy ssania.
3. Czasami wymagana jest kompensacja rezystancji powstającej między pipetą a komórką. Jest to kompensacja rezystancji szeregowej lub dostępu (Rs lub Ra), którą można przeprowadzić za pomocą oprogramowania lub ręcznie, używając pokrętła sterującego na wzmacniaczu. W naszych eksperymentach nie kompensujemy Ra, jednak doświadczenia są odrzucane, jeśli wartość ta odchyla się o więcej niż 25% od początkowej rezystancji dostępu.
4. Prądy toniczne aktywowane przez GABA rejestrowane w trybie whole-cell.

W konfiguracji whole-cell w neuronach piramidalnych obszaru CA1 hipokampa ustawiamy potencjał podtrzymujący na poziomie - 60 mV i czekamy od 5 do 10 minut, aby roztwór w pipecie wyrównał się z wnętrzem komórki. W tym czasie rejestracja staje się stabilna. W trakcie eksperymentu monitorujemy wartość rezystancji szeregowej.

Doświadczenia prowadzone są w technice voltage-clamp, a pomiarom podlega prąd przepływający przez populację kanałów w błonie całokomórkowej. Można odróżnić synaptyczne od pozasynaptycznych prądów aktywowanych przez GABA na podstawie ich charakteru fazowego i tonicznego. Antagonista SR95531 hamuje wszystkie prądy GABA_A. Spadek prądu podtrzymującego wskazuje na poziom tonicznego prądu aktywowanego przez GABA w neuronie.

Ponieważ interesuje nas toniczny prąd aktywowany przez GABA, który zależy od zewnątrzkomórkowego, otaczającego GABA w skrawku, zazwyczaj nie wykonujemy patch-clampu komórek na powierzchni, lecz komórek znajdujących się wewnątrz skrawka. Agoniści i antagoniści stosowani do modulacji kanałów GABA_A są aplikowane w roztworze kąpieli i docierają do komórek wewnątrz skrawka. Szybkość przepływu roztworu w komorze eksperymentalnej wynosi 2 - 3 ml / min.

6. Rejestracja prądów jednokanałowych:

Eksperymenty są przeprowadzane w konfiguracji patch-clamp cell-attached, inside-out lub outside-out (patrz poniżej), a rejestrowane są prądy przepływające przez pojedyncze cząsteczki kanałów, czyli prądy jednokanałowe. Ustawienia Axoclamp 200B: V-clamp, wzmocnienie (gain) 500, filtr 2 lub 5 kHz. Za pomocą oprogramowania PClamp kontrolujemy potencjał pipety, ustawiamy częstotliwość próbkowania danych na nie mniej niż 100 μs i rejestrujemy prądy. Aby zminimalizować szumy w rejestracjach jednokanałowych, objętość roztworu w kąpieli jest utrzymywana na niskim poziomie, tak aby zaledwie przykrywała skrawek tkanki.

1. Kanały aktywowane przez GABA w konfiguracji Cell-Attached. Po uzyskaniu uszczelnienia rzędu GΩ na błonie, znajduje się w trybie cell-attached i można rejestrować aktywność kanałów znajdujących się w fragmencie błony zamkniętym przez pipetę (patrz Rys. 1B). Ponieważ GABA nie przenika przez błonę komórkową, GABA wprowadza się do roztworu w pipecie, aby aktywować kanały w fragmencie błony. Pozasynaptyczne kanały aktywowane przez GABA aktywują się z opóźnieniem wynoszącym do kilku minut. Potencjał fragmentu błony (patch) = - potencjał pipety, tzn. gdy w programie PClamp ustawia się potencjał na -40 mV, jest on rejestrowany przez błonę jako depolaryzacja o 40 mV.
   Zaletą rejestracji w trybie cell-attached jest to, że kanał znajduje się w swoim naturalnym środowisku i pozostaje w kontakcie z normalnymi białkami i czynnikami wewnątrzkomórkowymi. Wadą jest to, że nie wiadomo dokładnie, przy jakim potencjale odbywa się rejestracja, ponieważ nie znany jest bezwzględny spoczynkowy potencjał błonowy, a potencjał w obrębie fragmentu błony jest określany zarówno przez potencjał pipety, jak i spoczynkowy potencjał błonowy komórki.
2. Kanały aktywowane przez GABA w konfiguracji Inside-Out. Będąc w trybie cell-attached, należy delikatnie unieść pipetę i przesunąć ją w bok, z dala od skrawka tkanki, korzystając z precyzyjnych ruchów mikromanipulatorów. W ten sposób uzyskuje się fragment błony w orientacji inside-out i można prowadzić rejestrację w trybie Inside-Out.
   Rejestracja odbywa się z fragmentu błony zamkniętego przez pipetę (patrz Rys. 1B). Podobnie jak w trybie cell-attached, w roztworze w pipecie znajduje się GABA w celu aktywacji kanałów. Jednakże leki przenikające przez dwuwarstwę lipidową, takie jak benzodiazepiny, barbiturany, propofol itp., mogą być podawane w roztworze kąpieli, ponieważ są one w stanie przeniknąć do wnętrza pipety i modulować kanały [14]. Potencjał fragmentu błony = - potencjał pipety i ponieważ nie nakłada się na niego spoczynkowy potencjał błonowy (jak w trybie cell-attached), potencjał fragmentu błony jest równy - potencjałowi pipety, np. jeśli potencjał podtrzymujący w PClamp zostanie ustawiony na -40 mV, potencjał fragmentu błony wynosi dokładnie 40 mV.
   Zaletą konfiguracji inside-out jest możliwość aplikacji leków lub enzymów na wewnętrzną powierzchnię błony i zbadania, czy wpływa to na właściwości kanału. Siły towarzyszące tworzeniu fragmentu inside-out nie oddziałują na środowisko błonowe kanału, co sprawia, że formowanie tej oderwanej konfiguracji fragmentu błony jest potencjalnie mniej obciążające dla kompleksu kanału niż w przypadku formowania fragmentu outside-out (patrz poniżej).
3. Kanały aktywowane przez GABA w konfiguracji Outside-Out. Będąc w trybie whole-cell, należy delikatnie unieść lub wycofać pipetę, korzystając z precyzyjnych ruchów mikromanipulatora. Jednocześnie należy obserwować okno w komputerze wyświetlające właściwości fragmentu błony. Podczas odsuwania pipety od komórki można zauważyć zanik przejściowych zmian pojemności i ponowne uzyskanie uszczelnienia rzędu GΩ. W ten sposób utworzono fragment błony w orientacji outside-out i można prowadzić rejestrację w trybie Outside-Out.
   Błona komórkowa w pewien sposób zamknęła otwór końcówki pipety; wewnętrzna strona błony jest zwrócona do wnętrza pipety, a pierwotna strona zewnętrzna błony jest zwrócona do komory rejestracyjnej (Rys. 1B). GABA oraz inne badane leki są teraz rozpuszczone w roztworze kąpieli. Potencjał fragmentu błony = potencjał pipety, tak jak w trybie whole-cell, np. jeśli potencjał podtrzymujący w PClamp zostanie ustawiony na 40 mV, potencjał fragmentu błony wynosi dokładnie 40 mV.
   Zaletą trybu outside-out jest precyzyjna znajomość potencjału błonowego, a ponieważ pierwotna strona zewnętrzna błony jest zwrócona do komory eksperymentalnej, stosowane leki mogą być rozpuszczone w roztworze kąpieli i łatwo aplikowane do kanałów oraz z nich wypłukiwane. Wadami są możliwe utraty białek i czynników wewnątrzkomórkowych, a nawet transbłonowych, które mogą być przyłączone do kanału i niezbędne dla jego pełnego funkcjonowania, ponieważ błona musiała się zamknąć, co mogło doprowadzić do utraty niektórych cząsteczek lub zniekształcenia lokalnego środowiska błonowego w tym procesie. Niemniej jednak, poszczególne konfiguracje fragmentów błony razem umożliwiają analizę właściwości kanałów na poziomie molekularnym, co nie jest obecnie możliwe za pomocą żadnej innej metody.

7. Analiza wyników:

Prądy pojedynczego kanału oraz prądy całej komórki są analizowane za pomocą oprogramowania PClamp. Do analizy zdarzeń synaptycznych wykorzystujemy Synaptosoft (GA, USA) lub AXOGraph (Sydney, Australia).

8. Reprezentatywne wyniki:

Rys. 2A przedstawia prądy pojedynczego kanału aktywowane stężeniem 20 nM GABA w konfiguracji cell-attached w neuronie ziarnistym zakrętu zębatego. Latencja aktywacji maksymalnej przewodności kanału wynosiła 2 minuty i 38 sekund, a maksymalna przewodność wyniosła 44 pS ¹⁵. Patch został zdepolaryzowany o 40 mV. Rys. 2B przedstawia przykłady zapisów prądów w konfiguracji whole-cell voltage-clamp z neuronów hipokampa szczura, identyfikując prądy toniczne i fazowe. Antagonista GABAA SR95531 hamuje zarówno prądy aktywowane przez GABA generowane pozasynaptycznie (toniczne), jak i synaptycznie (fazowe). Zastosowano antagonistę GABAA SR95531 (100 μM) do (Ba) neuronu zakrętu zębatego oraz (Bb) neuronu piramidowego CA1 traktowanego insuliną, co ujawniło prąd toniczny poprzez przesunięcie prądu bazowego wywołane blokowaniem kanałów pozasynaptycznych przez SR95531 (Ba,b) oraz zanik prądów synaptycznych, gdy SR95531 blokuje kanały synaptyczne (Bb). W warunkach bazowych neurony piramidowe CA1 nie wykazują tonicznych prądów aktywowanych przez GABA ⁶, jednak po wystawieniu neuronów na fizjologiczne stężenia insuliny ⁴ rozwijają się toniczne prądy aktywowane przez GABA.

Rysunek 1A. Przekrój mózgu szczura w obrębie hipokampa; zidentyfikowane obszary to warstwy komórek piramidowych CA1 i CA3 oraz warstwa komórek ziarnistych zakrętu zębatego (DG). B. Schemat konfiguracji patch-clamp.

Rycina 2A. Prądy pojedynczego kanału aktywowane przez 20 nM GABA w konfiguracji cell-attached w komórce ziarnistej zakrętu zębatego w skrawku mózgu szczura z obszaru hipokampa. Potencjał podtrzymujący został zdepolaryzowany o 40 mV (potencjał pipety = -40 mV). Gwiazdka (*, 1^{To jest tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć. Proszę podać treść do tłumaczenia.} bieżący ślad) identyfikuje, z czego wynikają prądy przedstawione w szybszej skali czasowej (2^nd bieżący ślad) został pobrany. B. Prądy całej komórki zarejestrowane w skrawku mózgu szczura z obszaru hipokampa w a. komórka ziarnista zakrętu zębatego i b. Neuron piramidalny obszaru CA1 w trybie clampingu napięciowego przy potencjale podtrzymującym -60 mV. W przypadku eksperymentów w obszarze CA1 skrawki inkubowano w 1 nM insulinie przez 2 h w temperaturze pokojowej przed rejestracją prądów.

Dyskusja

Prąd całej komórki reprezentuje sumę prądów generowanych przez aktywne kanały w komórce. Specyficzna farmakologia i przepuszczalność dla chlorków kanałów GABAA umożliwiają identyfikację prądów związanych z tymi kanałami. Przemijający charakter aktywacji kanałów synaptycznych oraz toniczna aktywacja kanałów pozasynaptycznych pozwalają na łatwe rozróżnienie między tymi dwiema populacjami kanałów GABAA wykazujących ekspresję w neuronie. Jednak tylko rejestracje pojedynczych kanałów pozwalają na badanie właściwości kinetycznych cząsteczek kanałów generujących prądy toniczne. W przeciwieństwie do kanałów synaptycznych, które aktywują się w czasie 100 μs, toniczne kanały GABAA aktywują się z opóźnieniem wynoszącym od kilku do kilkunastu minut od momentu aplikacji GABA ^{4,7,15,16,17,18}. To opóźniona aktywacja kanałów sprawia, że wielu ich właściwości nie można badać za pomocą rejestracji prądów całej komórki. Na poziomie pojedynczego kanału różne subpopulacje kanałów GABAA można zidentyfikować na podstawie zmiennych właściwości funkcjonalnych i farmakologicznych. Zatem, wykorzystując możliwości różnych konfiguracji patch-clamp, możliwe jest szczegółowe badanie funkcji molekularnej i farmakologii kanałów aktywowanych przez GABA, które generują prądy toniczne i synaptyczne w neuronach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dostępnych jest kilka systemów sprzętowych i programistycznych do techniki patch-clamp, które wszystkie działają w oparciu o te same podstawowe zasady. W naszym laboratorium do rejestracji i analizy eksperymentów wykorzystujemy wzmacniacze Axoclamp oraz oprogramowanie PClamp (Molecular Devices, USA). Inną popularną marką są wzmacniacze i oprogramowanie HEKA (HEKA Elektronik, Niemcy). Mikrokuwarka: Narishige MF-830 (Japonia); wibrotom: np. Leica VT1200S (Niemcy) lub wibrotom Campden Instruments (Wielka Brytania); mikroskop: Nikon Eclipse E600FN; kąpiel wodna; mikromanipulatory: wykonane na zamówienie oraz mikromanipulatory Narishige (Japonia); wypalarka elektrod: DMZ-universal (Niemcy) lub Narishige PC-10 (Japonia). Szkło elektrodowe: GC150F-15 (Harvard Apparatus, Wielka Brytania).