Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Podsumowanie

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Streszczenie

Komary przenoszą szereg odrębnych wirusów, w tym istotne patogeny ludzkie, takie jak wirus zachodniego Nilu, wirus dengi oraz wirus chikungunya. Wiele z tych wirusów nasiliło swoją aktywność w obszarach endemicznych i rozprzestrzeniło się na nowe terytoria, co wymusza wprowadzenie skutecznych programów nadzoru i kontroli w celu odpowiedzi na te zagrożenia. Jedną ze strategii monitorowania aktywności wirusów jest odłów dużej liczby komarów z obszarów endemicznych i badanie ich pod kątem zakażenia wirusowego. W niniejszym artykule opisujemy sposób obchodzenia się, przetwarzania i przesiewania komarów odłowionych w terenie w celu wykrycia zakaźnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Komary są sortowane według lokalizacji pułapki i gatunku, a następnie grupowane w pule zawierające ≤50 osobników. Próbki z pul są homogenizowane w soli fizjologicznej z buforem przy użyciu młyna mieszalnikowego, a fazę wodną inokuluje się na konfluentne hodowle komórek Vero (klon E6). Hodowle komórkowe są monitorowane pod kątem efektu cytopatycznego od 3. do 7. dnia po inokulacji, a wszelkie wirusy wyhodowane w kulturze komórkowej są identyfikowane za pomocą odpowiednich testów diagnostycznych. Stosując to podejście, wyizolowaliśmy 9 różnych wirusów z komarów odłowionych w Connecticut w USA, z których 5 znanych jest z wywoływania chorób u ludzi. Trzy z tych wirusów (wirus zachodniego Nilu, wirus Potosi oraz wirus La Crosse) stanowią nowe rekordy dla Ameryki Północnej lub regionu Nowej Anglii od 1999 roku. Zdolność do wykrywania szerokiej różnorodności wirusów jest kluczowa dla monitorowania zarówno uznanych, jak i nowo pojawiających się wirusów w populacji komarów.

Protokół

1. Sortowanie i identyfikacja komarów

1. Poniższe procedury są wykonywane na otwartym blacie laboratoryjnym w wyspecjalizowanym laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) przez personel przeszkolony w pracy z żywymi komarami. Przez cały czas trwania procedury zachowany jest „łańcuch chłodniczy”.
2. Zanurz komary dorosłe w stanie anestezji, umieszczając worek do zbierania komarów w zamrażarce o temperaturze -20° przez 5 minut. Przenieś worek do izolowanego pojemnika zawierającego suchy lód. Zamknij pokrywę i poddaj komary działaniu dwutlenku węgla przez 1-3 minuty, aby zapewnić całkowity nokdaun.
3. Wysyp znieczulone komary na schłodzoną wcześniej tackę umieszczoną na warstwie suchego lodu. Oddziel pojedyncze samice komarów za pomocą precyzyjnej pęsety i umieść je w plastikowych pojemniczkach do porcji. Przykryj pokrywką i ustaw pojemniczki na mokrym lodzie.
4. Zidentyfikuj gatunki komarów, korzystając z opisowych kluczy taksonomicznych opartych na morfologii zewnętrznej komarów, z pomocą stereomikroskopu sekcyjnego (zoom 10-60X) zamontowanego na elektronicznym stole chłodzącym.
5. Połącz zidentyfikowane gatunki komarów w puły liczące ≤50 osobników w probówkach z zatrzaskową zakrętką o pojemności 2 mL zawierających miedzianą kuleczkę BB. Probówki są oznaczane unikalnym identyfikatorem.
6. Po identyfikacji wszystkich komarów probówki są umieszczane w oznakowanych workach i przechowywane w styropianowej lodówce zawierającej suchy lód.
7. Przechowuj puły komarów w zamrażarce o temperaturze -80° C do czasu przeprowadzenia testów wirusologicznych.

2. Kwestie bezpieczeństwa biologicznego przy izolacji wirusa z komarów

1. Poniższe procedury są wykonywane w laboratorium o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) przez personel przeszkolony do pracy na tym poziomie zabezpieczeń¹. Zaplecze laboratoryjne, sprzęt, procedury i praktyki podlegają nadzorowi oraz inspekcjom instytucjonalnym, stanowym i federalnym. Przed przystąpieniem do poniższych protokołów należy przejść odpowiednie szkolenie i uzyskać niezbędne zgody.
2. Podczas każdej procedury należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak jednorazowe fartuchy, rękawiczki, przyłbice i maski z filtrem.
3. Powierzchnie robocze należy zdezynfekować 70% alkoholem przed i po zakończeniu procedur.
4. Hodowle komórkowe oraz materiały potencjalnie zakaźne są obsługiwane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (BSC).
5. Pule komarów są homogenizowane w młynku z mieszadłem umieszczonym wewnątrz BSC.
6. Homogenaty z komarów są wirowane w mikrowirówce z zabezpieczeniem przed aerozolami. Jeśli procedura ta nie może być przeprowadzona w BSC, operator powinien nosić maskę z filtrem podczas obsługi wirówki i wyjmowania z niej próbek.
7. Pipety i końcówki do pipet używane do obsługi materiału w BSC (komorze z laminarnym przepływem powietrza) są moczone w 10% roztworze wybielacza przed autoklawowaniem. Wszystkie odpady laboratoryjne są dekontaminowane w autoklawie przed utylizacją.

3. Przygotowanie komórek Vero

1. Zlać pożywkę z jednej dużej kolby do hodowli tkanek (175 cm²) konfluentnych komórek Vero (klon E6) do zlewki z odpadami zawierającej wybielacz.
2. Przemyć komórki Vero, dodając 5 ml PBS i delikatnie nim poruszając nad warstwą komórek oraz wzdłuż ścianek kolby, aby upewnić się, że cała monowarstwa została dokładnie pokryta.
3. Zlej PBS do zlewki na odpady.
4. Dodać 2,5 ml Trypsyny-EDTA i delikatnie wymieszać ruchem wirowym nad warstwą komórek, upewniając się, że cała monowarstwa została dokładnie pokryta.
5. Inkubować kolbę w inkubatorze przez 5 minut w temperaturze 37°C°C, 5% CO₂.
6. Delikatnie wstrząśnij i zakręć kolbą, aby oddzielić komórki od powierzchni dna. Komórki powinny łatwo odkleić się od powierzchni; jeśli tak się nie dzieje, inkubuj przez dodatkowe 1–5 minut.
7. Dodaj 5 ml Minimal Essential Media (MEM) z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), używając pipety serologicznej, a następnie pipetuj ciecz w górę i w dół 10–20 razy, aby rozbić skupiska komórek.
8. Dodać kolejne 15 ml MEM z 5% FBS, aby uzyskać objętość całkowitą 22,5 ml, i dokładnie wymieszać.
9. Umieść 40 małych kolb do hodowli tkankowych (25 cm²) w pozycji pionowej w dwóch statywach (20 kolb/statyw).
10. Umieścić statywy z kolbami wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza i zdjąć korki z kolb, układając je bezpośrednio przed naczyniami.
11. Do każdej kolby nanieś 4 ml pożywki MEM z 5% FBS za pomocą pipety serologicznej.
12. Przenieś po 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej kolby (˜stosunek pasażowania 1:6) Zakręć kolby.
13. Do pierwotnej dużej kolby do hodowli tkankowej zawierającej pozostałą zawiesinę komórek dodać 50 ml pożywki MEM z 5% FBS (˜(2,5 ml) i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Tę samą dużą kolbę do hodowli tkankowej można wykorzystywać do 5 pasaży, po czym należy przygotować nową kolbę w celu jej zastąpienia.
14. Umieść małe kolby do hodowli tkankowej w stosach na tacy. Poruszaj tacą okrężnymi ruchami, aby upewnić się, że pożywka równomiernie pokrywa dno kolb.
15. Umieścić małe kolby w inkubatorze w temperaturze 37°C° C, 5% CO₂ i inkubować przez noc aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji.

4. Przygotowanie pul komarów

1. Przez cały czas trwania procedur testowych należy utrzymywać niską temperaturę pul komarów. Podczas przetwarzania pul komarów należy używać wstępnie schłodzonych statywów do zamrażarki i kaset do młynka homogenizującego, lodowatych odczynników oraz wirówki z chłodzeniem.
2. Umieścić probówki zawierające komary w wstępnie schłodzonym statywie do zamrażarki i dodać do każdej probówki 1- 1.5 mL PBS-G.
3. Wyjąć kasety do młynka homogenizującego z zamrażarki. Umieścić 24 probówki w każdej kasecie, a następnie zabezpieczyć je w młynku homogenizującym.
4. Homogenizować próbki przez 4 minuty przy 25 cyklach/sekundę. Młynek homogenizujący wstrząsa probówkami z dużą prędkością, a znajdująca się w każdej z nich metalowa kulka BB rozdrabnia tkanki komarów.
5. Wirować probówki przez 6 minut przy 7,000 rpm.
6. Umieścić probówki z powrotem w statywach do zamrażarki aż do momentu inokulacji do komórek Vero.

5. Inokulacja komórek Vero homogenatami z pul komarów

1. Sprawdzić pod mikroskopem odwróconym co najmniej jedną flaskę z każdej serii, aby upewnić się, że konfluencja i kondycja komórek są odpowiednie; oczekiwany stopień pokrycia to około 80-90%.
2. Ustawić 20 małych flasek do hodowli tkankowych w statywie i opisać je numerami dostępu odpowiadającymi poszczególnym pulom komarów.
3. Poluzować zakrętki i odlać większość pożywki z flasek do naczynia na odpady. Pozostawić w flaskach tyle pożywki, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek.
4. Przenieść 100μL supernatantu z każdej przetworzonej puli komarów do odpowiadającej jej flaski do hodowli tkankowych.
5. Założyć zakrętkę i mocno ją dokręcić.
6. Położyć flaski poziomo na inkubatorze z wytrząsaniem na 5 minut (w temperaturze pokojowej) przy 35-40 rpm.
7. Ustawić 20 flasek do hodowli tkankowych pionowo w statywie i umieścić je w BSC.
8. Odkręcając zakrętki z 3 flasek jednocześnie, nalać do każdej z nich 4 mL pożywki wzrostowej za pomocą pipety serologicznej; ponownie zakręcić flaski.
9. Należy upewnić się, że końcówka pipety nie dotyka szyjki ani krawędzi flaski. W przypadku kontaktu z flaską należy zmienić końcówkę pipety.
10. Inkubować flaski do hodowli tkankowych w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂.

6. Przesiewowe badanie komórek Vero pod kątem wzrostu wirusa

1. Przez okres od 3 do 7 dni po inokulacji monitorować zaszczepione kolby z kulturami tkankowymi pod kątem oznak infekcji wirusowej, czyli efektu cytopatycznego (CPE).
2. Wizualnie ocenić kultury komórkowe pod kątem CPE i/lub kontaminacji, przechylając kolby i badając pożywkę gromadzącą się na ich dnie. Pożywka stanie się mętna w miarę degradacji komórek podczas CPE lub w wyniku wzrostu drożdżaków, grzybów bądź kontaminacji bakteryjnej.
3. Ponownie zbadać pod mikroskopem odwróconym kultury komórkowe, w których pożywka jest mętna. Wirusy spowodują deformację komórek i ich odrywanie się od ścianek kolb z kulturą. Kultury komórkowe z widocznymi zanieczyszczeniami, np. drożdżakami, innymi bakteriami, grzybami lub dużymi ilością szczątków komarów, poddać ponownemu badaniu poprzez przepuszczenie oryginalnej puli komarów przez filtr strzykawkowy 0.22μM.
4. Aseptycznie przenieść 1-2 mL pożywki z dodatnich pod kątem obecności wirusa kultur komórkowych do oznakowanych krioprobówek za pomocą pipety serologicznej.
5. Kultury wirusów przechowywać w temperaturze -80° C do czasu ich identyfikacji przy użyciu odpowiednich testów diagnostycznych.

7. Przygotowanie odczynników

1. MEM, 5% FBS. Rozpuścić 37,6 g sproszkowanego MEM w końcowej objętości 4 L dd H₂0. Rozlać roztwór do butelek z pożywką w alikwotach 500 mL i wysterylizować w autoklawie. Po ochłodzeniu roztworu do każdej butelki aseptycznie dodać 26 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 5,2 mL L-Glutaminy, 5,2 mL antybiotyku/antymykotyku oraz 10,4 mL 7,5% wodorowęglanu sodu. Przechowywać w temperaturze 4° C.
2. PBS-G. Rozpuścić 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na₂HPO₄, 0,4 g KH₂PO₄ oraz 4 mL 0,5% czerwieni fenolowej w 1000 mL dd H₂0. Jeśli to konieczne, dostosować pH do poziomu 7,1-7,4 za pomocą 2 N NaOH. W osobnym zlewce zagotować 600 mL H₂0. Zdjąć z płyty grzejnej, dodać 10 g żelatyny i rozpuścić. Dodać roztwór rozpuszczonej żelatyny do roztworu PBS i uzupełnić końcową objętość do 2 L za pomocą dd H₂O. Rozlać roztwór do butelek w ilościach 100 mL i wysterylizować w autoklawie. Po ochłodzeniu roztworu aseptycznie dodać 42,8 mL inaktywowanej ciepłem surowicy króliczej oraz 1,4 mL antybiotyku/antymykotyku. Przechowywać w temperaturze 4° C.
3. PBS do przemywania komórek. Dodać 50 mL 10X PBS Dulbecco do 400 mL dd H₂O. Dostosować pH do poziomu 7,1 za pomocą 2 N NaOH. Uzupełnić końcową objętość do 500 mL za pomocą dd H₂O. Przefiltrować roztwór za pomocą próżniowej jednostki filtrującej 0,2uM. Rozlać do probówek z nakrętką 8 mL w alikwotach 5 mL. Przechowywać w temperaturze 4° C.

8. Reprezentatywne wyniki

Z komarów zebranych podczas ciągłego monitoringu w całym stanie Connecticut w latach 1997-2010 wyizolowano dziewięć różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych (tabela 1). Pięć z tych wirusów wiadomo, że wywołuje choroby u ludzi, a najważniejszymi patogenami są wirus zachodniego Nilu oraz wirus wschodniego zapalenia mózgu koni. Do nowych odkryć należą: pierwsza izolacja WNV z komarów zebranych w Ameryce Północnej w 1999 roku², pierwsza izolacja wirusa Potosi w północno-wschodnich USA w 2000 roku³ oraz pierwsza izolacja wirusa La Crosse w Nowej Anglii w 2005 roku⁴.

Wirus	Rodzina	Liczba izolatów	Liczba lokalizacji	Liczba lat wykrywania	Choroba u ludzi	Ref.
Wirus Nilu Zachodniego	Flaviviridae	1,002	94	12	Od umiarkowanej do ciężkiej, gorączka, zapalenie mózgu	2,5
Wirus wschodniego zapalenia mózgu koni	Togaviridae	292	41	10	Ciężka, zapalenie mózgu	6,7
Wirus Highlands J	Togaviridae	178	39	11	Nieznana	6
Wirus Jamestown Canyon	Bunyaviridae	305	74	14	Od łagodnej do umiarkowanej, gorączka, zapalenie opon mózgowych	8
Wirus Potosi	Bunyaviridae	259	76	4	Nieznana	3
Wirus Cache Valley	Bunyaviridae	114	51	8	Od łagodnej do ciężkiej, gorączka, choroba neurologiczna w dwóch udokumentowanych przypadkach
Wirus Trivittatus	Bunyaviridae	83	21	11	Nieznana
Wirus La Crosse	Bunyaviridae	1	1	1	Od umiarkowanej do ciężkiej, zapalenie mózgu	4
Wirus Flanders	Rhabdoviridae	4	4	2	Nieznana

Tabela 1. Wirusy wykryte w komarach zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero. Komary zostały zebrane podczas nadzoru stanowego w Connecticut w latach 1997-2010.

Dyskusja

Test z użyciem hodowli komórek Vero służy jako skuteczna metoda przesiewowa w celu wykrycia różnorodnych wirusów w komarach zebranych w terenie. Kontrastuje to z metodami molekularnymi, które są skierowane specyficznie na jeden lub kilka wybranych wirusów. Co więcej, stwierdziliśmy, że test z użyciem hodowli komórek Vero jest równie czuły, a być może nawet bardziej niż RT-PCR⁷, i dostarcza izolatów wirusów, które są przechowywane w naszej kolekcji referencyjnej do przyszłych badań. Niemniej jednak, systemy hod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	16140
Przeciwbakteryjny/przeciwgrzybiczy	GIBCO, by Life Technologies	15240
Wodorowęglan sodu NaHCO33, 7,5% roztwór	GIBCO, by Life Technologies	25080
L-glutamina 200 mM 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Sproszkowana minimalna pożywka niezbędna (MEM)	GIBCO, by Life Technologies	11700
10X Dulbecco’bufor PBS	GIBCO, by Life Technologies	14080
trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	15400
Surowica królicza	GIBCO, firmy Life Technologies	16120
Komórki Vero (klon E6)	ATCC	CRL-1586
Małe baloniki do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 25 cm2	Falcon BD	353112
Duże butle do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 175 cm²2	Falcon BD	353108
Kuleczki BB powlekane miedzią’s, 4,5 mm	Crosman	0767
Młyn mieszający	Retsch	MM300
Stativy do zamrażarek Isopack	Eppendorf	022510240