Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komary przenoszą szereg odrębnych wirusów, w tym istotne patogeny ludzkie, takie jak wirus zachodniego Nilu, wirus dengi oraz wirus chikungunya. Wiele z tych wirusów nasiliło swoją aktywność w obszarach endemicznych i rozprzestrzeniło się na nowe terytoria, co wymusza wprowadzenie skutecznych programów nadzoru i kontroli w celu odpowiedzi na te zagrożenia. Jedną ze strategii monitorowania aktywności wirusów jest odłów dużej liczby komarów z obszarów endemicznych i badanie ich pod kątem zakażenia wirusowego. W niniejszym artykule opisujemy sposób obchodzenia się, przetwarzania i przesiewania komarów odłowionych w terenie w celu wykrycia zakaźnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Komary są sortowane według lokalizacji pułapki i gatunku, a następnie grupowane w pule zawierające ≤50 osobników. Próbki z pul są homogenizowane w soli fizjologicznej z buforem przy użyciu młyna mieszalnikowego, a fazę wodną inokuluje się na konfluentne hodowle komórek Vero (klon E6). Hodowle komórkowe są monitorowane pod kątem efektu cytopatycznego od 3. do 7. dnia po inokulacji, a wszelkie wirusy wyhodowane w kulturze komórkowej są identyfikowane za pomocą odpowiednich testów diagnostycznych. Stosując to podejście, wyizolowaliśmy 9 różnych wirusów z komarów odłowionych w Connecticut w USA, z których 5 znanych jest z wywoływania chorób u ludzi. Trzy z tych wirusów (wirus zachodniego Nilu, wirus Potosi oraz wirus La Crosse) stanowią nowe rekordy dla Ameryki Północnej lub regionu Nowej Anglii od 1999 roku. Zdolność do wykrywania szerokiej różnorodności wirusów jest kluczowa dla monitorowania zarówno uznanych, jak i nowo pojawiających się wirusów w populacji komarów.
Protokół
1. Sortowanie i identyfikacja komarów
- Poniższe procedury są wykonywane na otwartym blacie laboratoryjnym w wyspecjalizowanym laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) przez personel przeszkolony w pracy z żywymi komarami. Przez cały czas trwania procedury zachowany jest „łańcuch chłodniczy”.
- Zanurz komary dorosłe w stanie anestezji, umieszczając worek do zbierania komarów w zamrażarce o temperaturze -20° przez 5 minut. Przenieś worek do izolowanego pojemnika zawierającego suchy lód. Zamknij pokrywę i poddaj komary działaniu dwutlenku węgla przez 1-3 minuty, aby zapewnić całkowity nokdaun.
- Wysyp znieczulone komary na....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test z użyciem hodowli komórek Vero służy jako skuteczna metoda przesiewowa w celu wykrycia różnorodnych wirusów w komarach zebranych w terenie. Kontrastuje to z metodami molekularnymi, które są skierowane specyficznie na jeden lub kilka wybranych wirusów. Co więcej, stwierdziliśmy, że test z użyciem hodowli komórek Vero jest równie czuły, a być może nawet bardziej niż RT-PCR7, i dostarcza izolatów wirusów, które są przechowywane w naszej kolekcji referencyjnej do przyszłych badań. Niemniej jednak, systemy hod.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność za istotny wkład dr. Johna Andersona, dr. Andrew Maina i dr Shirley Tirrell w niniejsze badanie. Praca ta była częściowo finansowana z grantów przyznanych przez Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) oraz Departament Rolnictwa USA (58-6615-1-218, CONH00768 oraz CONH00773).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płodowa surowica bydlęca | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Przeciwbakteryjny/przeciwgrzybiczy | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Wodorowęglan sodu NaHCO33, 7,5% roztwór | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-glutamina 200 mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Sproszkowana minimalna pożywka niezbędna (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’bufor PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| trypsyna-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Surowica królicza | GIBCO, firmy Life Technologies | 16120 | |
| Komórki Vero (klon E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Małe baloniki do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Duże butle do hodowli tkankowej, z nakrętkami z filtrem, 175 cm²2 | Falcon BD | 353108 | |
| Kuleczki BB powlekane miedzią’s, 4,5 mm | Crosman | 0767 | |
| Młyn mieszający | Retsch | MM300 | |
| Stativy do zamrażarek Isopack | Eppendorf | 022510240 |
Bibliografia
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
