Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Podsumowanie

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Streszczenie

Ścisła regulacja homeostazy jonowej w całym organizmie jest niezbędna do zapobiegania takim wyniszczającym stanom jak odwodnienie.¹ Z drugiej strony, szybkie przepływy jonów na poziomie komórkowym są wymagane do inicjacji potencjałów czynnościowych w komórkach pobudliwych.² Regulacja sodu odgrywa ważną rolę w obu tych przypadkach; jednak obecnie nie istnieje metoda ciągłego monitorowania poziomu sodu in vivo ³, a wewnątrzkomórkowe sondy sodowe ⁴ nie dostarczają tak szczegółowych wyników jak sondy wapniowe. W celu wypełnienia obu tych luk opracowano fluorescencyjne nanoczujniki, które mogą monitorować stężenia sodu in vitro oraz in vivo.^5,6 Czujniki te opierają się na technologii optodów selektywnych wobec jonów i składają się z plastyfikowanych cząsteczek polimerowych, w których osadzone są elementy specyficzne dla rozpoznawania sodu, fluorofory wrażliwe na pH oraz dodatki.^7-9 Mechanicznie, element rozpoznający sód ekstrahuje sód do czujnika. ¹⁰ Ekstrakcja ta powoduje, że fluorofor wrażliwy na pH uwalnia jon wodoru w celu zachowania neutralności ładunku wewnątrz czujnika, co wywołuje zmianę fluorescencji. Czujniki sodowe są odwracalne i selektywne względem sodu w stosunku do potasu, nawet przy wysokich stężeniach wewnątrzkomórkowych.⁶ Mają one średnicę około 120 nm i są powlekane glikolem polietylenowym w celu zapewnienia biokompatybilności. Wykorzystując techniki mikroiniekcji, czujniki mogą być wprowadzane do cytoplazmy komórek, gdzie wykazano ich zdolność do monitorowania czasowej i przestrzennej dynamiki sodu w bijących miocytach serca.¹¹ Dodatkowo śledzono one zmiany stężeń sodu w czasie rzeczywistym in vivo po podaniu podskórnym u myszy.³ W niniejszej pracy szczegółowo wyjaśniamy i demonstrowamy metodologię wytwarzania fluorescencyjnych nanoczujników sodu oraz krótko prezentujemy zastosowania biologiczne, do których nasze laboratorium wykorzystuje te nanoczujniki: mikroiniekcję czujników do komórek oraz podskórną iniekcję czujników u myszy.

Protokół

1. Przygotowanie optody

Przed przygotowaniem optody należy odmierzyć alikwoty składników, aby można było je łatwo zmierzyć i przechowywać.

1. Fiolkę zawierającą 50 mg jonoforu sodowego X (NaIX) oraz fiolkę zawierającą 50 mg boranu sodu tetrakis[3,5-bis(trifluorometylo)fenylo] (NaTFPB) rozpuszcza się odpowiednio w tetrahydrofuranie (THF) i rozdziela na aliquoty do 1,5 ml polistyrenowych probówek do wirowania. W dygestorium rozpuścić 50 mg NaIX w 1 ml THF w fiolce transportowej i wymieszać, aby upewnić się, że substancja stała całkowicie się rozpuściła. Przenieść 100 μl tego roztworu do 10 oddzielnych probówek do wirowania. Powtórzyć procedurę dla NaTFPB. Pozostawić THF do odparowania w dygestorium przez noc, opisać probówki i umieścić je w lodówce w temperaturze 4°C do przechowywania. W ten sposób otrzymuje się aliquoty 5 mg suchego NaIX i NaTFPB.
2. Chromoionofor III (CHIII) rozpuścić w 1 ml THF i przenieść do 3 ml szklanej fiolki. Do fiolki transportowej po CHIII dodać kolejny 1 ml THF, aby rozpuścić pozostałości CHIII, a następnie dodać to do 3 ml szklanej fiolki. Łączna objętość wyniesie teraz 2 ml. Przenieść 1 ml roztworu CHIII w THF do dwóch oddzielnych 1,5 ml szklanych fiolek z zakrętkami teflonowymi. Roztwór CHIII przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przy końcowym stężeniu 5 mg/ml.

Te alikwoty i roztwory zostaną wykorzystane do przygotowania materiału optody.

3. Pipetuj 66 μl sebacynianu bis(2-etylheksylu) (DOS) do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml z zakrętką z powłoką teflonową – jest to fiolka optody. DOS jest roztworem lepkim, dlatego należy zachować ostrożność, aby zapewnić przeniesienie odpowiedniej ilości roztworu do fiolki. Objętość ta odpowiada ˜ 60 mg DOS.
4. Odważ 30 mg wysokocząsteczkowego poli(chlorku winylu) (PVC) i przenieś go do fiolki optody.
5. Następnie dodaj odmierzone komponenty funkcjonalne do fiolki optody, aby stworzyć pożądaną optodę. Względne stężenia CHIII, NaIX i NaTFPB będą determinować odpowiedź sensora na sód. Stężenia te można dostosować tak, aby sensor reagował optymalnie na stężenia wewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 10 mM, lub na stężenia zewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 150 mM. Ponadto prawdopodobna jest zmienność partii odczynników od dostawcy, dlatego kalibracja sensorów jest niezbędna, aby sprawdzić, czy dla każdej nowej partii komponentów chemicznych występuje prawidłowa odpowiedź. Tutaj opisujemy metodę tworzenia sensora ze stężeniami typowo stosowanymi do pomiarów sodu wewnątrzkomórkowego.
6. W dygestorium chemicznym przenieś 100 μl roztworu CHIII w THF o stężeniu 5 mg/ml do fiolki optody.
7. Rozpuść 5 mg NaIX w 300 μl THF i przenieś 300 μl do fiolki optody; odpowiada to 5 mg NaIX.
8. Rozpuść odmierzoną porcję 5 mg NaTFPB w 500 μl THF i przenieś 20 μl roztworu do fiolki optody; odpowiada to 0,1 mg NaTFPB.
9. Dodaj 80 μl THF do fiolki optody.
10. Roztwór w fiolce optody zawiera 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg NaIX, 0,2 mg NaTFPB oraz 0,5 mg CHIII w 500 μl THF. Delikatnie mieszaj fiolkę na wortexie, aż cały PVC się rozpuści. Optoda powinna mieć czerwony kolor. Całkowita ilość THF dodana do fiolki powinna wynosić 500 μL, niezależnie od zastosowanego stosunku komponentów.
11. Pozostaw pozostały THF w porcjach NaIX i NaTFPB do odparowania przez noc i ponownie opisz probówki, podając prawidłową ilość substancji chemicznej.

2. Tworzenie nanoczujników

1. Do szklanej fiolki o pojemności 4 dramów pipetujemy 100 μl 10 mg/ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N -[Methoxy(Polyethyleneglycol)-550] w chloroformie (PEG-lipid). Pozostawiamy chloroform do odparowania w dygestorium. Proces ten można przyspieszyć, osuszając roztwór strumieniem azotu lub sprężonym powietrzem.
2. Do fiolki z PEG-lipid dodajemy 4 ml wybranego roztworu wodnego. Fiolkę umieszczamy na podnośniku laboratoryjnym pod końcówką sonikatora i podnosimy ją tak, aby końcówka była zanurzona w roztworze na głębokość około 7 mm, a następnie sonikujemy przy niskiej mocy przez 30 sekund. W tym przypadku używamy cyfrowego sonikatora Branson ustawionego na 15% amplitudy z końcówką typu step horn o średnicy ½ cala. Roztwór wodny może być dowolny. Na przykład, aby określić odpowiedź sensorów, stosujemy 10 mM HEPES pH 7.2 z zasadą trizma.
3. Podczas sonikowania roztworu mieszamy 50 μl materiału optody z 50 μl dichlorometanu w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.6 ml. Mieszamy za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodność mieszaniny.
4. Ustawiamy sterownik sonikatora na 3 minuty. Uruchamiamy sonikację i w jej trakcie dodajemy roztwór mieszaniny optody do fiolki, zanurzając końcówkę pipety w roztworze i podając 100 μl roztworu jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór powinien zmienić kolor na niebieski, w zależności od zastosowanego roztworu wodnego.
5. Kontynuujemy sonikację przez około 30 sekund, a następnie opuszczamy podnośnik tak, aby końcówka sonikatora była zanurzona w roztworze na głębokość około 2 mm. Powinno to doprowadzić do napowietrzenia roztworu, który stanie się mętny. Krok ten pomaga usunąć z roztworu resztki THF i dichlorometanu.
6. Po zakończeniu sonikacji pobieramy roztwór nanosensorów do strzykawki 5 ml. Mocujemy filtr strzykawkowy 0.2 μm i przelewamy roztwór nanosensorów do szklanej fiolki z zakrętką. Roztwór powinien być klarowny i niebieski, jeśli zastosowano roztwór wodny zawierający mniej niż 10 mM sodu o pH poniżej około 9. W przeciwnym razie roztwór powinien być bezbarwny lub różowy.

3. Wyznaczanie odpowiedzi nanoczujnika

Metoda ta jest stosowana do określenia odpowiedzi nanoczujników zaprojektowanych do pomiaru wewnątrzkomórkowego sodu. W przypadku nanoczujników stężenia sodu zewnątrzkomórkowego zaleca się stosowanie innych stężeń.

1. Przygotować roztwory stokowe 10 mM HEPES (0 Na) oraz 1 M chlorku sodu (NaCl) w 10 mM HEPES (1 M Na), a następnie dostosować pH każdego z tych roztworów do wartości 7,2 za pomocą bazy trizmy. W stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml zmieszać roztwory stokowe 0 Na i 1 M Na, aby przygotować roztwory o stężeniach NaCl wynoszących: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM.
2. Do oznaczenia odpowiedzi użyć płytki 96-dołkowej z optycznym dnem. Do trzech dołków w jednej kolumnie dodać po 100 μl roztworu sodu o danym stężeniu. W ten sposób powstanie układ 3 x 10 dołków.
3. Do każdego dołka dodać 100 μl świeżo przygotowanych nanoczujników, a następnie włożyć płytkę do fluorometru do mikropłytek. W badaniu wykorzystano urządzenie Molecular Devices Spectramax M3.
4. Odczytać wartości dla każdego dołka przy następujących długościach fal:

Wzbudzenie (nm)	Emisja (nm)	Próg odcięcia (nm)
488	570	530
488	670	610
639	680	665

Intensywność nanoczujnika przy każdej długości fali zależy od stężenia sodu. Wybór długości fali zależy od zastosowań. Do pomiarów powolnej dynamiki wewnątrzkomórkowej stosujemy 488 nm/570 nm (wzbudzenie/emisja) oraz 488 nm/670 nm, co pozwala nam na obliczenie stosunku dwóch długości fal i zredukowanie szumu.

5. Tradycyjnie dane z optody przelicza się na wartości α według wzoru: α = (I - I_min)/(I_max - I_min), gdzie I jest natężeniem przy danym stężeniu sodu, I_min to najniższe natężenie w pomiarach odpowiedzi, a I_max to najwyższe natężenie w pomiarach odpowiedzi. Przelicz na α albo stosunek natężenia przy 570 nm do natężenia przy 670 nm, albo natężenie przy 680 nm.
6. Użyj oprogramowania do wykresów (w naszym laboratorium zazwyczaj stosuje się Excel lub Origin), aby narysować zależność α od logarytmu stężenia sodu, przyjmując logarytm zerowego stężenia sodu jako -1. Dopasuj do odpowiedzi krzywą sigmoidalną. Na podstawie krzywej oblicz stężenie sodu dla α = 0,5, co reprezentuje stężenie, przy którym sensor wykazuje optymalną odpowiedź.
7. Dostosuj stosunek CHIII, NaIX i NaTFPB w optodzie, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnej odpowiedzi w pobliżu interesującego stężenia sodu.

4. Obrazowanie wewnątrzkomórkowe

1. Do pomiarów wewnątrzkomórkowych nanosensory przygotowuje się w roztworze glukozy o stężeniu 5 mg/ml w wodzie, a następnie wstrzykuje się je do komórek za pomocą mikroiniekcji.
2. Komórki należy hodować lub przenieść do szalki z szklanym dnem lub do komory obrazującej z szklanym dnem z lamellki.
3. Komórki inkubuje się w przezroczystym medium lub roztworze Tyrode'a. Komorę obrazującą lub szalkę montuje się na mikroskopie epifluorescencyjnym. W tej procedurze wykorzystano konfokalny mikroskop Zeiss LSM 7.
4. Kapilary szklane wyciąga się za pomocą wyciągacza do pipet. Użyto urządzenia sutter flaming brown p-97 z rurki szklanej o średnicy zewnętrznej 1 mm i wewnętrznej 0.78 mm, aby uzyskać końcową średnicę końcówki około 300-500 nm.
5. Pipetę napełnia się od tyłu roztworem nanosensorów, używając strzykawki i igły Hamiltona lub ładowarki do mikrokońcówek i pipety.
6. Pipetę montuje się w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora i podłączonym do systemu iniekcji sterowanego ciśnieniowo. W tym przypadku zastosowano mikromanipulator Burleigh EXFO PCS 6000 oraz injektor firmy medical systems corporation.
7. Pipetę opuszcza się na komórkę i wprowadza do cytoplazmy; czasami konieczne jest lekkie „stuknięcie” uchwytu manipulatora, aby przebić błonę. Następnie wstrzykuje się roztwór nanosensorów i szybko wycofuje pipetę.

5. Obrazowanie in vivo

Wszystkie procedury zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Northeastern University.

1. Nanosensory do obrazowania in vivo w przestrzeni zewnątrzkomórkowej przygotowuje się w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i dostraja tak, aby uzyskać optymalną odpowiedź na sód przy jego stężeniu 135 mM.
2. Do przygotowania do iniekcji oraz obrazowania fluorescencyjnych nanosensorów u myszy używamy systemu IVIS Lumina II wraz z dołączoną jednostką anestezji. Dezynfekujemy komory indukcyjne i obrazujące. Myszy CD1 nude (o masie około 20g) umieszczamy w komorze indukcyjnej i poddajemy działaniu izofluranu. Procent stężenia izofluranu oraz przepływ tlenu będą zależeć od gatunku i masy myszy. Oczekujemy, aż myszy zostaną w pełni znieczulone.
3. Po znieczuleniu myszy wyjmujemy je z komory indukcyjnej i przenosimy do komory obrazującej. Utrzymujemy myszy w stanie anestezji. W przypadku każdej myszy dezynfekujemy wybrane miejsca iniekcji.
4. Jałową strzykawkę insulinową 31G napełniamy 10 μL nanosensorów, upewniając się, że usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza.
5. Za pomocą pęsety chwytamy niewielki fałd skóry wzdłuż grzbietu myszy w wybranym miejscu iniekcji. Trzymając skórę, wprowadzamy strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry, prowadząc igłę równolegle do powierzchni skóry.
6. Przed wstrzyknięciem sensorów odciągamy tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Następnie delikatnie przesuwamy igłę w prawo i w lewo, aby stworzyć w skórze niewielką przestrzeń. Pozwoli to zminimalizować ciśnienie wsteczne, które powoduje wyciek sensorów z miejsca iniekcji. Wstrzykujemy sensory i delikatnie wyjmujemy strzykawkę.
7. Delikatnie uciskamy miejsce iniekcji i wycieramy wszelki roztwór, który mógł wycieknąć. Pozwoli to zminimalizować fluorescencję z sensorów, które nie zostały wstrzyknięte do skóry.
8. Powtarzamy kroki od 5.4 do 5.7, aż do osiągnięcia pożądanej liczby miejsc iniekcji. Zaleca się wykonanie sześciu iniekcji w równych odstępach po lewej i prawej stronie grzbietu. W przypadku każdej myszy wymieniamy igłę, jeśli stanie się ona trudna do wprowadzenia w skórę. Igieł nie należy używać wielokrotnie u różnych osobników. Pozwoli to zminimalizować ryzyko przenoszenia chorób lub zanieczyszczenia krzyżowego między myszami.
9. W celu obrazowania fluorescencyjnych sensorów sodu pozyskujemy obrazy myszy w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjnym, korzystając z zestawów filtrów najlepiej dopasowanych do widma 640 nm/680 nm (pobudzenie/emisja) nanosensorów, które jednocześnie minimalizują autofluorescencję skóry.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Krzywe odpowiedzi pięciu różnych zestawów nanoczujników na sod. Każdy zestaw reprezentuje nanoczujniki o różnych formulacjach optod, które zawierały taką samą ilość CHIII, NaTFPB, PVC i DOS, ale różną ilość NaIX. Dane przekształcono w wartości α, wykorzystując intensywności przy 639/680 nm. Dane stanowią średnią z 3 pomiarów, słupki błędów pominięto dla przejrzystości; zastosowano dopasowanie krzywej sygmoidalnej w programie Origin. W tej krzywej odpowiedzi maksymalne zastosowane stężenie sodu wynosiło 500 mM. Wartości Kd nanoczujników sodu dla sodu wynosiły od 10 mM (pomarańczowe romby) do około 150 mM (czarne kwadraty).

Rycina 2. Wstrzyknięte kardiomiocyty noworodkowe. Komórki hodowano na szkiełkach podstawkowych, zamocowano w mikroskopie i wstrzyknięto do nich sodowe nanoczujniki. Przedstawiono obraz fluorescencyjny (pobudzenie 639 nm), w świetle przechodzącym oraz nałożenie obu obrazów (overlay). Należy zauważyć, że występuje pewna agregacja czujników, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię, czujniki rozprzestrzeniły się w całym cytosolu i nie stwierdzono ich akumulacji w jądrze komórkowym.

Rysunek 3. Podskórne wstrzyknięcia nanosensorów sodu u myszy. Wykonano dziewięć różnych wstrzyknięć nanosensorów sodu do przestrzeni podskórnej myszy nude. Nałożono na siebie obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencyjne (640/680).

Dyskusja

Formowanie nanoczujników nie powinno zająć więcej niż 10 minut po przygotowaniu roztworu optody i wysuszeniu lipidu PEG. Optody można nie tylko szybko przygotować w razie potrzeby, ale przechowywane w temperaturze 4 °C mogą one zachować stabilność przez wiele miesięcy. Wykazaliśmy, że nanoczujniki po utworzeniu są stabilne w roztworze przez co najmniej tydzień; należy jednak zachować ostrożność, aby zapobiec fotowybielaniu w tym czasie, chroniąc nanoczujniki przed światłem.⁶ Choć w niniejszej pracy zaprezentowano nanoczujniki sodowe, optody stworzono dla większości biologicznie istotnych jonów, takich jak potas i chlorek.^10,12 Rozszerzyliśmy również tę technologię na małe cząsteczki, takie jak glukoza.¹³

Oprócz generowania nanoczujników do monitorowania różnych analitów, nanoczujniki te można modyfikować w inny sposób, co uczyni je użytecznymi w większości eksperymentów biologicznych. Na przykład powłokę powierzchniową, w tym przypadku poli(glikol etylenowy), można łatwo zmienić, stosując dowolną amfifilną cząsteczkę rozpuszczalną w wodzie. Umożliwia to funkcjonalizację tych nanocząstek dla różnych zastosowań lub celów. Rozmiar nanocząstek można również regulować poprzez zmianę powłoki powierzchniowej, intensywności sonikacji lub zastosowanego rozpuszczalnika.

Fluorescencyjne wskaźniki wapnia okazały się nieocenione w określaniu wewnątrzkomórkowego przesyłania sygnałów wapniowych; jednakże żadne dostępne barwniki czułe na sód nie posiadają tak idealnych właściwości. Od lat opracowywane są nanocząsteczki optodowe, które mają zapewnić alternatywną metodę obrazowania jonów wewnątrzkomórkowych.¹⁴ Opierając się na tych wcześniejszych badaniach, stworzyliśmy nanoczujniki specyficzne dla wewnątrzkomórkowego obrazowania sodu, które – jak miejmy nadzieję – pozwolą zrozumieć, w jaki sposób sygnalizacja sodowa wpływa na funkcje komórkowe oraz jakie zmiany w sygnalizacji prowadzą do określonych chorób.

Zastosowanie fluorescencyjnych nanoczujników in vivo stanowi małoinwazyjną alternatywę czasu rzeczywistego dla monitorowania analitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak pobieranie krwi.³ Wykazano, że nanoczujniki sodu i glukozy oparte na powyższej technologii pozwalają na śledzenie zmian odpowiednio poziomu sodu i glukozy in vivo.^3,13 Obecnie istnieją jednak ograniczenia tej metody jako narzędzia monitorującego. Na przykład czujniki muszą zawierać fluorofor o widmie wystarczająco przesuniętym w stronę bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować tło autofluorescencji skóry.¹⁵ Po drugie, obecna technika wstrzykiwania nie zapewnia jednorodnego wprowadzenia nanoczujników, co może wynikać z błędów takich jak zmienność głębokości iniekcji. Mimo tych ograniczeń, opracowanie tych fluorescencyjnych nanoczujników i ich pomyślna demonstracja mogą uczynić z tych sensorów nieocenione narzędzie badawcze oraz metodę monitorowania stanu zdrowia pacjentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw aparatury IVIS Lumina II	Caliper Life Sciences	126273
Myszy nago CD-1	Charles River Laboratories	Kod szczepu: 086	Z niedoborem odporności
Strzykawki insulinowe	BD Biosciences	328438	3/10 ccml , 8 mm, 31G
PVC o wysokiej masie cząsteczkowej	Sigma-Aldrich
DOS	Sigma-Aldrich
CHIII	Sigma-Aldrich
NaTFPB	Sigma-Aldrich
NaIX	Sigma-Aldrich
Cienkościenna kapilara szklana	Sutter Instrument Co.
lipid PEG	Avanti Polar Lipid, Inc
Tabela 1. Zawiera listę odczynników i sprzętu użytych w tej procedurze. Wszystkie pozostałe powszechnie stosowane odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma.