Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Podsumowanie

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Streszczenie

Ścisła regulacja homeostazy jonowej w całym organizmie jest niezbędna do zapobiegania takim wyniszczającym stanom jak odwodnienie.¹ Z drugiej strony, szybkie przepływy jonów na poziomie komórkowym są wymagane do inicjacji potencjałów czynnościowych w komórkach pobudliwych.² Regulacja sodu odgrywa ważną rolę w obu tych przypadkach; jednak obecnie nie istnieje metoda ciągłego monitorowania poziomu sodu in vivo ³, a wewnątrzkomórkowe sondy sodowe ⁴ nie dostarczają tak szczegółowych wyników jak sondy wapniowe. W celu wypełnienia obu tych luk opracowano fluorescencyjne nanoczujniki, które mogą monitorować stężenia sodu in vitro oraz in vivo.^5,6 Czujniki te opierają się na technologii optodów selektywnych wobec jonów i składają się z plastyfikowanych cząsteczek polimerowych, w których osadzone są elementy specyficzne dla rozpoznawania sodu, fluorofory wrażliwe na pH oraz dodatki.^7-9 Mechanicznie, element rozpoznający sód ekstrahuje sód do czujnika. ¹⁰ Ekstrakcja ta powoduje, że fluorofor wrażliwy na pH uwalnia jon wodoru w celu zachowania neutralności ładunku wewnątrz czujnika, co wywołuje zmianę fluorescencji. Czujniki sodowe są odwracalne i selektywne względem sodu w stosunku do potasu, nawet przy wysokich stężeniach wewnątrzkomórkowych.⁶ Mają one średnicę około 120 nm i są powlekane glikolem polietylenowym w celu zapewnienia biokompatybilności. Wykorzystując techniki mikroiniekcji, czujniki mogą być wprowadzane do cytoplazmy komórek, gdzie wykazano ich zdolność do monitorowania czasowej i przestrzennej dynamiki sodu w bijących miocytach serca.¹¹ Dodatkowo śledzono one zmiany stężeń sodu w czasie rzeczywistym in vivo po podaniu podskórnym u myszy.³ W niniejszej pracy szczegółowo wyjaśniamy i demonstrowamy metodologię wytwarzania fluorescencyjnych nanoczujników sodu oraz krótko prezentujemy zastosowania biologiczne, do których nasze laboratorium wykorzystuje te nanoczujniki: mikroiniekcję czujników do komórek oraz podskórną iniekcję czujników u myszy.

Protokół

1. Przygotowanie optody

Przed przygotowaniem optody należy przygotować alikwoty składników, aby można było je łatwo odmierzyć i przechowywać.

1. Fiolkę zawierającą 50 mg jonoforu sodowego X (NaIX) oraz fiolkę zawierającą 50 mg boranu sodu tetrakis[3,5-bis(trifluorometylo)fenylowego] (NaTFPB) rozpuszcza się odpowiednio w tetrahydrofuranie (THF), a następnie rozdziela na alikwoty w polistyrenowych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. W dygestorium chemicznym rozpuścić 50 mg NaIX w 1 ml THF w fiolce transportowej i wymieszać, aby upewnić się, że substancja stała całkowicie się rozpuściła. Przenieść 100 μl tego roztworu do 10 oddzielnych probówek wirówkowych. Powtórzyć czynność dla NaTFPB. Pozostawić THF do odparowania w dygestorium chemicznym przez noc, opisać probówki wirówkowe i umieścić je w lodówce w temperaturze 4 °C w celu przechowywania. W ten sposób otrzymuje się alikwoty 5 mg suchego NaIX i NaTFPB.
2. Rozpuścić chromoionofor III (CHIII) w 1 ml THF i przenieść do szklanej fiolki o pojemności 3 ml. Do fiolki transportowej po CHIII dodać kolejny 1 ml THF, aby rozpuścić pozostałości CHIII, i dodać to do szklanej fiolki o pojemności 3 ml. Łączna objętość wyniesie teraz 2 ml. Przenieść 1 ml roztworu CHIII w THF do dwóch oddzielnych szklanych fiolek o pojemności 1,5 ml z zakrętkami pokrytymi teflonem. Przechowywać roztwór CHIII w lodówce w temperaturze 4 °C przy końcowym stężeniu 5 mg/ml.

Te alikwoty i roztwory zostaną wykorzystane do przygotowania materiału optody.

3. Do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml z nakrętką z powłoką teflonową (fiolka optody) pipetuj 66 μl sebacjanu bis(2-etyloheksylu) (DOS). DOS jest roztworem lepkim, dlatego należy zachować ostrożność, aby do fiolki trafiła odpowiednia ilość roztworu. Objętość ta odpowiada ˜ 60 mg DOS.
4. Odważ 30 mg polichlorku winylu (PVC) o wysokiej masie cząsteczkowej i przenieś go do fiolki optody.
5. Następnie dodaj do fiolki optody odmierzone komponenty funkcjonalne, aby stworzyć pożądaną optodę. Względne stężenia CHIII, NaIX i NaTFPB określą odpowiedź czujnika na sód. Stężenia te można dostosować tak, aby czujnik idealnie reagował na stężenia wewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 10 mM, lub stężenia zewnątrzkomórkowe, przy Kd wynoszącym 150 mM. Ponadto prawdopodobna będzie zmienność partii odczynników od dostawcy, dlatego konieczna jest kalibracja czujników, aby ustalić, czy każda nowa partia komponentów chemicznych wykazuje prawidłową odpowiedź. Tutaj opisujemy metodę tworzenia czujnika ze stężeniami zazwyczaj stosowanymi do pomiarów sodu wewnątrzkomórkowego.
6. W dygestorium przenieś 100 μl roztworu CHIII o stężeniu 5 mg/ml w THF do fiolki optody.
7. Rozpuść 5 mg NaIX w 300 μl THF i przenieś 300 μl do fiolki optody; odpowiada to 5 mg NaIX.
8. Rozpuść odmierzone 5 mg NaTFPB w 500 μl THF i przenieś 20 μl roztworu do fiolki optody; odpowiada to 0,1 mg NaTFPB.
9. Dodaj 80 μl THF do fiolki optody.
10. Roztwór w fiolce optody zawiera 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg NaIX, 0,2 mg NaTFPB i 0,5 mg CHIII w 500 μl THF. Delikatnie mieszaj fiolkę na wortexie, aż cały PVC się rozpuści. Optoda powinna mieć czerwony kolor. Całkowita ilość THF dodana do fiolki powinna wynosić 500 μL, niezależnie od zastosowanego stosunku komponentów.
11. Pozostaw pozostały THF w aliquotach NaIX i NaTFPB do odparowania przez noc, a następnie ponownie opisz probówki z podaniem prawidłowej ilości substancji chemicznej.

2. Tworzenie nanoczujników

1. Do szklanej fiolki o pojemności 4 dram nanieść pipetą 100 μl 10 mg/ml 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N -[Methoxy(Polyethyleneglycol)-550] w chloroformie (lipid-PEG). Pozostawić chloroform do odparowania w dygestorium. Proces ten można przyspieszyć, osuszając roztwór prądem azotu lub sprężonym powietrzem.
2. Do fiolki z lipidem-PEG dodać 4 ml odpowiedniego roztworu wodnego. Umieścić fiolkę na podnośniku laboratoryjnym pod końcówką sonikatora i podnieść fiolkę tak, aby końcówka była zanurzona w roztworze na głębokość około 7 mm, a następnie sonikować przy niskiej mocy przez 30 sekund. W tym przypadku zastosowano cyfrowy sonikator Branson z amplitudą ustawioną na 15% i końcówką typu step horn o średnicy ½ cala. Roztwór wodny może być dowolny. Na przykład, aby określić odpowiedź czujników, zastosowano 10 mM HEPES pH 7,2 z bazą trizma.
3. Podczas sonikacji roztworu wymieszać 50 μl materiału optody z 50 μl dichlorometanu w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml. Wymieszać za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodne zmieszanie.
4. Ustawić sterownik sonikatora na 3 minuty sonikacji. Rozpocząć sonikację i podczas trwania procesu dodać roztwór mieszaniny optody do fiolki, zanurzając końcówkę pipety w roztworze i podając 100 μl roztworu w jednym szybkim, równomiernym wtrysku. W zależności od zastosowanego roztworu wodnego, roztwór powinien zmienić kolor na niebieski.
5. Kontynuować sonikację przez około 30 sekund, a następnie obniżyć podnośnik tak, aby końcówka sonikująca była zanurzona w roztworze na głębokość około 2 mm. Powinno to spowodować napowietrzenie roztworu, który stanie się nieprzezroczysty. Ten krok pomaga usunąć z roztworu resztki THF i dichlorometanu.
6. Po zakończeniu sonikacji pobrać roztwór nanoczujnika do strzykawki o pojemności 5 ml. Założyć filtr strzykawkowy 0,2 μm i przelać roztwór nanoczujnika do szklanej fiolki z nakrętką. Roztwór powinien być klarowny i niebieski, jeśli zastosowano roztwór wodny zawierający mniej niż 10 mM sodu i o pH poniżej około 9. W przeciwnym razie roztwór powinien być bezbarwny lub różowy.

3. Określanie odpowiedzi nanoczujnika

Metoda ta jest stosowana do określania odpowiedzi nanoczujników zaprojektowanych do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu sodu. W przypadku nanoczujników stężenia sodu pozakomórkowego zaleca się stosowanie różnych stężeń.

1. Przygotować roztwory zapasowe 10 mM HEPES (0 Na) oraz 1M chlorku sodu (NaCl) w 10 mM HEPES (1 M Na), a następnie dostosować pH każdego z tych roztworów do wartości 7,2, używając trizmy (trizma base). W stożkowych probówkach do wirowania o pojemności 50 ml wymieszać roztwory zapasowe 0 Na i 1 M Na, aby przygotować roztwory o stężeniach NaCl wynoszących kolejno: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM.
2. Do oznaczenia odpowiedzi użyć płytki 96-dołkowej z dnem optycznym. Do trzech dołków w jednej kolumnie dodać po 100 μl roztworu sodu o danej koncentracji. W ten sposób powstanie układ 3 x 10 dołków.
3. Do każdego dołka dodać 100 μl świeżo przygotowanych nanoczujników, a następnie umieścić płytkę w fluorometrze do mikropłytek. W badaniu wykorzystano urządzenie Molecular Devices Spectramax M3.
4. Odczytać wartości dla każdego dołka przy następujących długościach fal:

Wzbudzenie (nm)	Emisja (nm)	Próg odcięcia (nm)
488	570	530
488	670	610
639	680	665

Intensywność sygnału nanoczujnika przy każdej długości fali zależy od stężenia sodu. Wybór długości fali zależy od zastosowań. Do pomiarów powolnej dynamiki wewnątrzkomórkowej stosujemy 488 nm/570 nm (wzbudzenie/emisja) oraz 488 nm/670 nm, co pozwala nam na obliczenie stosunku tych dwóch długości fal i redukcję szumów.

5. Tradycyjnie dane z optody przekształca się w wartości α według wzoru: α = (I - I_min)/(I_max - I_min), gdzie I to natężenie przy danej koncentracji sodu, I_min to najniższe natężenie w pomiarach odpowiedzi, a I_max to najwyższe natężenie w pomiarach odpowiedzi. Przekształć w wartość α albo stosunek natężenia przy 570 nm do natężenia przy 670 nm, albo natężenie przy 680 nm.
6. Używając oprogramowania do wykresów (w naszym laboratorium zazwyczaj stosuje się Excel lub Origin), nanieś α w funkcji logarytmu koncentracji sodu, przyjmując logarytm dla zerowej koncentracji sodu jako -1. Dopasuj do odpowiedzi krzywą sigmoidalną. Na podstawie krzywej oblicz koncentrację sodu dla α = 0,5, co reprezentuje koncentrację, przy której czujnik reaguje optymalnie.
7. Dostosuj stosunek CHIII, NaIX i NaTFPB w optodzie, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnej odpowiedzi w zakresie interesującej koncentracji sodu.

4. Obrazowanie wewnątrzkomórkowe

1. Do pomiarów wewnątrzkomórkowych nanosensory przygotowuje się w 5 mg/ml glukozy w wodzie, a następnie wstrzykuje je do komórek za pomocą mikroiniekcji.
2. Hodować lub przenieść komórki do szalki z szklanym dnem lub do komory obrazowania z szklaną lamellą na dnie.
3. Inkubować komórki w przezroczystym medium lub roztworze Tyrode'a. Zamocować komorę obrazowania lub szalkę do mikroskobu epifluorescencyjnego. W tej procedurze zastosowano konfokalny mikroskop Zeiss LSM 7.
4. Wyciągnąć kapilary szklane za pomocą wyciągacza pipet. Użyto urządzenia sutter flaming brown p-97 ze szkła o średnicy zewnętrznej (OD) 1 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 0,78 mm, aby uzyskać końcową średnicę końcówki około 300-500 nm.
5. Napełnić pipetę od tyłu roztworem nanosensorów, używając strzykawki i igły Hamiltona lub urządzenia do napełniania mikrokońcówek i pipety.
6. Zamocować pipetę w uchwycie przytwierdzonym do mikromanipulatora i podłączonym do systemu iniekcji sterowanego ciśnieniem. Zastosowano mikromanipulator Burleigh EXFO PCS 6000 oraz injektor firmy medical systems corporation.
7. Obniżyć pipetę nad komórkę i wprowadzić ją do cytoplazmy; czasami konieczne jest „stukanie” w uchwyt manipulatora, aby przebić błonę. Wstrzyknąć roztwór nanosensorów i szybko wycofać pipetę.

5. Obrazowanie in vivo

Wszystkie procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Northeastern.

1. Nanosensory do obrazowania pozakomórkowego in vivo przygotowuje się w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i dostraja tak, aby uzyskano optymalną odpowiedź na sód przy jego stężeniu 135 mM.
2. Do przygotowania zestawu do iniekcji oraz obrazowania fluorescencyjnych nanosensorów u myszy wykorzystujemy system IVIS Lumina II wraz z powiązaną jednostką anestezjologiczną. Dezynfekujemy komory indukcyjne i obrazujące. Umieszczamy myszy CD1 nude (o masie około 20g) w komorze indukcyjnej i poddajemy je działaniu izofluranu. Procent zawartości izofluranu oraz przepływ tlenu będą różnić się w zależności od gatunku i masy myszy. Czekamy, aż myszy zostaną w pełni znieczulone.
3. Po znieczuleniu myszy przenosimy je z komory indukcyjnej do komory obrazującej. Utrzymujemy zwierzęta w stanie anestezji. U każdej myszy dezynfekujemy wybrane miejsca iniekcji.
4. Sterylną strzykawkę insulinową 31G napełniamy 10 μL nanosensorów, upewniając się, że usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza.
5. Za pomocą pęsety chwytamy małą fałdę skóry wzdłuż grzbietu myszy w wybranym miejscu iniekcji. Trzymając skórę, wprowadzamy igłę strzykawki w skórę ściętym końcem do góry, prowadząc igłę równolegle do powierzchni skóry.
6. Przed wstrzyknięciem sensorów odciągamy tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Następnie delikatnie przesuwamy igłę w prawo i w lewo, aby stworzyć w skórze przestrzeń (kieszonkę). Zminimalizuje to ciśnienie wsteczne, które powoduje wyciek sensorów z miejsca wstrzyknięcia. Wstrzykujemy sensory i delikatnie wyjmujemy strzykawkę.
7. Delikatnie uciskamy miejsce iniekcji i wycieramy wszelki roztwór, który mógł wycieknąć z miejsca wstrzyknięcia. Pozwoli to zminimalizować fluorescencję pochodzącą z sensorów, które nie zostały wstrzyknięte do skóry.
8. Powtarzamy kroki od 5.4 do 5.7, aż do uzyskania pożądanej liczby miejsc iniekcji. Zaleca się wykonanie sześciu wstrzyknięć w równych odstępach po lewej i prawej stronie grzbietu. U każdej myszy wymieniamy igłę, jeśli stanie się ona trudna do wprowadzenia w skórę. Igły nie powinny być współdzielone między myszami. Zminimalizuje to transmisję chorób lub kontaminację krzyżową między zwierzętami.
9. W celu obrazowania fluorescencyjnych sensorów sodu wykonujemy zdjęcia myszy w świetle przechodzącym (brightfield) oraz fluorescencyjnym, stosując zestawy filtrów najlepiej dopasowane do spektrum 640 nm/680 nm (pobudzenie/emisja) nanosensorów, które jednocześnie minimalizują autofluorescencję skóry.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Krzywe odpowiedzi pięciu różnych zestawów nanoczujników na sód. Każdy zestaw reprezentuje nanoczujniki z różnych formulacji optod, które zawierały tę samą ilość CHIII, NaTFPB, PVC i DOS, ale zmienne ilości NaIX. Dane przekształcono w wartości α, wykorzystując intensywności przy 639/680 nm. Dane stanowią średnią z 3 pomiarów, słupki błędów pominięto dla przejrzystości, a krzywą sigmoidalną dopasowano przy użyciu programu Origin. W tej krzywej odpowiedzi maksymalne użyte stężenie sodu wynosiło 500 mM. Wartości Kd nanoczujników sodu dla sodu mieściły się w zakresie od 10 mM (pomarańczowe romby) do około 150 mM (czarne kwadraty).

Rycina 2. Wstrzyknięte kardiomiocyty noworodkowe. Komórki hodowano na szkiełkach podstawkowych, umieszczono w mikroskopie i wstrzyknięto do nich sodowe nanoczujniki. Przedstawiono obraz fluorescencyjny (wzbudzenie 639 nm), w świetle przechodzącym oraz obraz nałożony. Zauważalna jest pewna agregacja czujników, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię, czujniki rozprzestrzeniły się w całym cytozolu i nie przedostały się do jądra komórkowego.

Rysunek 3. Podskórne wstrzyknięcie nanoczujników sodu u myszy. Wykonano dziewięć różnych wstrzyknięć nanoczujników sodu do przestrzeni podskórnej myszy nago. Nałożono na siebie obrazy w polu jasnym oraz fluorescencyjne (640/680).

Dyskusja

Formowanie nanoczujników nie powinno zająć więcej niż 10 minut po przygotowaniu roztworu optody i wysuszeniu lipidu PEG. Optody można nie tylko szybko przygotować w razie potrzeby, ale przechowywane w temperaturze 4 °C mogą one zachować stabilność przez wiele miesięcy. Wykazaliśmy, że nanoczujniki po utworzeniu są stabilne w roztworze przez co najmniej tydzień; należy jednak zachować ostrożność, aby zapobiec fotowybielaniu w tym czasie, chroniąc nanoczujniki przed światłem.⁶ Choć w niniejszej pracy zaprezentowano nanoczujniki sodowe, optody stworzono dla większości biologicznie istotnych jonów, takich jak potas i chlorek.^10,12 Rozszerzyliśmy również tę technologię na małe cząsteczki, takie jak glukoza.¹³

Oprócz generowania nanoczujników do monitorowania różnych analitów, nanoczujniki te można modyfikować w inny sposób, co uczyni je użytecznymi w większości eksperymentów biologicznych. Na przykład powłokę powierzchniową, w tym przypadku poli(glikol etylenowy), można łatwo zmienić, stosując dowolną amfifilną cząsteczkę rozpuszczalną w wodzie. Umożliwia to funkcjonalizację tych nanocząstek dla różnych zastosowań lub celów. Rozmiar nanocząstek można również regulować poprzez zmianę powłoki powierzchniowej, intensywności sonikacji lub zastosowanego rozpuszczalnika.

Fluorescencyjne wskaźniki wapnia okazały się nieocenione w określaniu wewnątrzkomórkowego przesyłania sygnałów wapniowych; jednakże żadne dostępne barwniki czułe na sód nie posiadają tak idealnych właściwości. Od lat opracowywane są nanocząsteczki optodowe, które mają zapewnić alternatywną metodę obrazowania jonów wewnątrzkomórkowych.¹⁴ Opierając się na tych wcześniejszych badaniach, stworzyliśmy nanoczujniki specyficzne dla wewnątrzkomórkowego obrazowania sodu, które – jak miejmy nadzieję – pozwolą zrozumieć, w jaki sposób sygnalizacja sodowa wpływa na funkcje komórkowe oraz jakie zmiany w sygnalizacji prowadzą do określonych chorób.

Zastosowanie fluorescencyjnych nanoczujników in vivo stanowi małoinwazyjną alternatywę czasu rzeczywistego dla monitorowania analitów w porównaniu z innymi metodami, takimi jak pobieranie krwi.³ Wykazano, że nanoczujniki sodu i glukozy oparte na powyższej technologii pozwalają na śledzenie zmian odpowiednio poziomu sodu i glukozy in vivo.^3,13 Obecnie istnieją jednak ograniczenia tej metody jako narzędzia monitorującego. Na przykład czujniki muszą zawierać fluorofor o widmie wystarczająco przesuniętym w stronę bliskiej podczerwieni, aby zminimalizować tło autofluorescencji skóry.¹⁵ Po drugie, obecna technika wstrzykiwania nie zapewnia jednorodnego wprowadzenia nanoczujników, co może wynikać z błędów takich jak zmienność głębokości iniekcji. Mimo tych ograniczeń, opracowanie tych fluorescencyjnych nanoczujników i ich pomyślna demonstracja mogą uczynić z tych sensorów nieocenione narzędzie badawcze oraz metodę monitorowania stanu zdrowia pacjentów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw aparatury IVIS Lumina II	Caliper Life Sciences	126273
Myszy nago CD-1	Charles River Laboratories	Kod szczepu: 086	Z niedoborem odporności
Strzykawki insulinowe	BD Biosciences	328438	3/10 ccml , 8 mm, 31G
PVC o wysokiej masie cząsteczkowej	Sigma-Aldrich
DOS	Sigma-Aldrich
CHIII	Sigma-Aldrich
NaTFPB	Sigma-Aldrich
NaIX	Sigma-Aldrich
Cienkościenna kapilara szklana	Sutter Instrument Co.
lipid PEG	Avanti Polar Lipid, Inc
Tabela 1. Zawiera listę odczynników i sprzętu użytych w tej procedurze. Wszystkie pozostałe powszechnie stosowane odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma.