Zoptymalizowany protokół hodowli Fopius arisanus, parasytoida much owocówek z rodziny Tephritidae

Podsumowanie

Fopius arisanus jest parasitoidem jaj i larw muszek owocówek z rodziny Tephritidae, który jest z sukcesem wykorzystywany w biologicznej kontroli tych istotnych tropikalnych szkodników. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół hodowli F. arisanus na małą skalę z wykorzystaniem łatwo dostępnych materiałów.

Streszczenie

Fopius arisanus (Sonan) jest istotnym parazytoidem muszek owocówek z rodziny Tephritidae z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, jest jednym z zaledwie trzech znanych parazytoidów z podrodziny Opiinae, które infekują gospodarza na etapie jaja¹. Po drugie, posiada on szeroki zakres potencjalnych gospodarzy wśród muszek owocówek. Prawdopodobnie ze względu na cykl życiowy, F. arisanus był z powodzeniem stosowany w biologicznej walce z muszkami owocówkami w wielu regionach tropikalnych^2-4. Jedną z przeszkód w szerokim zastosowaniu F. arisanus do zwalczania muszek owocówek jest trudność w stworzeniu stabilnej kolonii laboratoryjnej^5-9. Mimo tych trudności, w latach 90. badacze z USDA opracowali niezawodną metodę utrzymywania populacji laboratoryjnych F. arisanus^10-12. Istnieje znaczne zainteresowanie biologią F. arisanus^13,14, szczególnie w odniesieniu do jego zdolności do kolonizacji szerokiej gamy gospodarzy z rodziny Tephritidae^14-17; zainteresowanie to jest potęgowane przez niepokojące rozprzestrzenianie się szkodników z rodzaju Bactrocera na nowe kontynenty w ostatniej dekadzie¹⁸. Dalsze badania nad F. arisanus oraz dodatkowe wdrożenia tego gatunku jako czynnika biologicznej kontroli zyskają dzięki optymalizacji i ulepszeniu metod hodowli. W niniejszym protokole i powiązanym artykule wideo opisujemy zoptymalizowaną metodę hodowli F. arisanus opartą na wcześniej opisanym podejściu¹². Opisana tutaj metoda pozwala na hodowlę F. arisanus na niewielką skalę bez użycia owoców, przy wykorzystaniu materiałów dostępnych w regionach tropikalnych na całym świecie i przy stosunkowo niskim nakładzie pracy ręcznej.

Protokół

1. Przygotowanie jaj muszek owocówek gospodarza do zapasożytowania

1. Przygotuj podłoże dla jaj muszek owocówek do zaparasytowania, przygotowując płytki wypełnione agarem (alternatywnie: Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ; opcja bardziej ekonomiczna) o wymiarach 10 cm na bok i głębokości 1,5 cm. Przygotuj agar o stężeniu 9 g na litr wody.
2. Wypełnij płytki po brzegi płynnym agarem (około 70 ml), a następnie pozostaw je do ostygnięcia i stężenia (przynajmniej przez 45 minut).
3. Gdy bloki agaru stwardnieją, nałóż pojedynczą warstwę papierowej chusteczki (pojedyncza warstwa chusteczek Georgia Pacific 'Preference'), pokrywając wierzch każdego bloku. Chusteczka powinna łatwo przywrzeć do agaru dzięki wilgotności powierzchni.
4. Na powierzchnię bloków agaru pokrytą chusteczką nanieś 0,5 ml zawiesiny jaj muszek owocówek w wodzie. W naszej hodowli odpowiada to około 6000 jaj Bactrocera dorsalis (12000 jaj na ml).
5. Użyj czystego pędzla o szerokości 2,5 cm zanurzonego w wodzie, aby równomiernie rozprowadzić jaja muszek owocówek po powierzchni chusteczki.
6. Umieść jaja muszek owocówek pod dolnym sitami klatek z parasytoidami, aby umożliwić składanie jaj. Opuki pod spód dolnego sita, aby usunąć martwe pasożyty, które mogłyby blokować dostęp do jaj. Najlepiej, aby dolne sito nie dotykało jaj.
7. Pozostaw pasożyty do składania jaj przez noc i kolejny dzień, łącznie przez około 21 godzin. Jest to czas wystarczający, aby wysoki odsetek jaj został zaparasytowany. Dłuższa ekspozycja grozi superparasytozą.

2. Wyklucie i przepoczwarzenie sparazytowanych muchowatych owocowych

1. Przygotować pojemnik hodowlany, umieszczając od 3 do 3,5 przygotowanych bloków agaru z zapasożyczonymi jajami na każde 1,25 litra pożywki dla muszek owocówek¹⁹, tak aby jaja były skierowane do góry.
2. Umieścić pojemnik z pożywką i jajami na podwyższeniu nad warstwą drobnoziarnistego wermikulitu lub płukanego piasku o grubości 1,5 cm w większym pojemniku do pupacji. Przykryć pojemnik do pupacji pokrywą i zakleić krawędzie taśmą papierową. Wermikulit można ponownie wykorzystać po przesianiu (patrz poniżej).
3. Upewnić się, że między górną krawędzią pojemnika z pożywką a pokrywą pojemnika do pupacji znajduje się wystarczająca przestrzeń, aby larwy muszek mogły wypełznąć i „wypaść”²⁰ do znajdującego się poniżej wermikulitu.
4. Przenieść pojemniki do pupacji do pomieszczenia o temperaturze 27°C i wilgotności względnej (RH) 80 % na jeden tydzień. Przez pierwsze cztery dni przykryć pojemniki ciemną tkaniną, a następnie zdjąć ją na pozostałe dni.
5. Usunąć pożywkę dla larw po tygodniu, gdy larwy wypadną i wnikną do wermikulitu w celu pupacji. Jeśli w wermikulicie znajdują się larwy, pozostawić je do pupacji przez noc.
6. Przesiać poczwarki z wermikulitu. Rozpocząć od sita o dużych oczkach (około 3 mm), a następnie użyć sita ręcznego, aby usunąć pozostałe grudki wermikulitu.

3. Sortowanie i selekcja

1. Poczwarki zawierające F. arisanus można częściowo oddzielić od niezpasożytowanych muszek owocówek na podstawie ich wielkości. Należy zebrać poczwarki o średnicy od 1,65 do 2,26 mm, ponieważ będą one wzbogacone w zapasożytowane muchy.¹² Puparia mniejsze zawierają głównie niedorozwinięte parasytoidy, natomiast większe poczwarki zawierają głównie muchy. Należy również zauważyć, że w przypadku zapasożytowanych poczwarek odsetek samic koreluje dodatnio z ich wielkością¹².
2. Do sortowania poczwarek według wielkości można zastosować różne metody. Opiszemy metodę mechaniczną z wykorzystaniem specjalnie skonstruowanego sortera wielkości²¹.
3. Umieść poczwarki w lejku na górze podajnika wibracyjnego, który powoli podaje materiał do sortera wielkości.
4. Podaj poczwarki do sortera wielkości, który składa się z pary lekko rozbieżnych wałków toczących ustawionych pod kątem 30°. Poczwarki wpadają pojedynczo, zależnie od wielkości, do szeregu szczelin, które poprzez lejek prowadzą do dziesięciu oddzielnych pojemników.
5. Zbierz z pojemników poczwarki o wielkości od 1,65 do 2,26 mm i umieść je w klatce wylęgowej na kolejne 7 dni, aż większość much wykluje się z niezpasożytowanych poczwarek.
6. Następnie użyj wentylatora, aby oddzielić puste puparia od tych, w których wciąż znajdują się owady.

4. Wyklucie i utrzymanie F. arisanus

1. Do utrzymania kolonii F. arisanus należy użyć klatki do hodowli parazytoidów z wyjmowanym szklanym frontem, o długości około 25 cm na bok. Klatka posiada siatkę o oczkach 1mm² na górnej ściance oraz dwóch ściankach bocznych. Tył klatki jest pokryty gumową płachtą z otworem o średnicy 9 cm w celu zapewnienia dostępu. Dno klatki posiada otwór pokryty od wewnątrz siatką 1-2mm², wystarczająco duży, aby umożliwić umieszczenie dwóch bloków agaru z jajami muszki owocówki dla owipozycji parazytoidów.
2. Klatki hodowlane powinny posiadać również przyciemnioną część wzdłuż dolnej ćwiartki szklanego frontu, aby zminimalizować dostęp światła, co zapobiega gromadzeniu się parazytoidów przy przedniej ściance klatki, co mogłoby skutkować podwyższoną śmiertelnością.
3. Umieść około 11 g wybranych poczwarek w plastikowych pojemnikach o średnicy około 9 cm. Powinno to przynieść około 600-700 parazytoidów na klatkę. Dobór rozmiaru powinien skutkować udziałem około 60% samic.
4. Do pojemników przymocuj siatkowe pokrywki. Pokrywki powinny być pokryte siatką 2 mm², która umożliwi dorosłym osobnikom F. arsianus opuszczenie pojemników po wyjściu z poczwarek, ale zatrzyma pozostałe muszki owocówki.
5. Parazytoidów należy utrzymywać w temperaturze 24°C i wilgotności RH około 45%, przy fotoperiodzie 12:12 i dobrej wentylacji. W przypadku zaobserwowania wysokiej śmiertelności, jej redukcja może nastąpić poprzez wystawienie klatek na zewnątrz na kilka godzin dziennie lub zwiększenie wentylacji. Parazytoidy powinny być gotowe do składania jaj w ciągu kolejnego tygodnia i pozostawać produktywne przez następne dwa tygodnie.
6. Nanieś nierozcieńczony miód wirówkowy wzdłuż górnej części klatek co najmniej trzy razy w tygodniu lub zawsze wtedy, gdy dostępny miód wyschnie. Miód wirówkowy nakładaj wąskimi pasmami za pomocą opuszka palca. Należy pamiętać, że jeśli pasma będą zbyt grube, miód będzie ściekać do wnętrza klatki; jeśli będą zbyt cienkie, miód szybko wyschnie i będzie wymagał częstego ponownego nakładania.
7. Na górnych częściach klatek umieść bloki agaru (10 cm x 10 cm x 4 cm), aby zapewnić parazytoidom wilgoć. Powinny być one wymieniane dwa razy w tygodniu.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przedstawiamy tutaj wyniki procedur kontroli jakości przeprowadzonych w zakładzie hodowli F. arisanus USDA-ARS w Hilo na Hawajach w okresie od 5 stycznia do 22 czerwca 2010 roku. Hodowla w lokalizacji w Hilo na skalę opisaną w tym artykule wideo i protokole została rozpoczęta w sierpniu 2009 roku, a początkowe problemy i dostosowania do nowej lokalizacji zostały w większości rozwiązane do stycznia. Zatem dane te są reprezentatywne dla wyników, jakie inni badacze mogliby uzyskać, zakładając własną kolonię, jeśli będą przestrzegać opisanego protokołu i posiadają ogólne doświadczenie w hodowli owadów. W tym okresie utrzymywaliśmy małą kolonię F. arisanus: tygodniowo przygotowywano 4 klatki do utrzymania parazytoidów, co odpowiadało około 3600 osobników F. arisanus.

Wstępna kontrola wzbogaconych wskaźników zapasości przeprowadzona została poprzez pobranie 2 g próbki poczek w przedziale wielkości 1,65 – 2,26 mm (wzbogacone) przed dodatkowym tygodniem rozwoju w klatce hodowlanej (tzn. bezpośrednio po usunięciu pożywki dla larw oraz przesianiu i segregacji poczek według wielkości; określamy je mianem „wczesnych poczek”). W ciągu pierwszych trzech miesięcy 2010 roku średnia proporcja pasożytów w próbce wzbogaconej wynosiła 0,46 (SD=0,18). W kolejnym kwartale średnia ta wyniosła 0,58 (SD=0,08), co odzwierciedlało stabilizację kolonii i procedur hodowlanych w nowej lokalizacji. Należy zauważyć, że wzbogacone poczki, które nie zostały skutecznie zapasożycone, obejmują te, z których nie wyłoniły się osobniki oraz te, z których wyłoniły się muchy.

Po dodatkowym tygodniu w klatce zbiorczej, po usunięciu pustych pupariów, pobrano kolejną próbkę o masie dwóch gramów („późne poczwarki”). Muszki owocówki stanowiły mniej niż 1% tej drugiej próbki. Niski odsetek muszek owocówek wynika częściowo z wcześniejszego wylotu much w porównaniu z pasożytami, w związku z czym większość much pozostała w pojemniku zbiorczym.

Wreszcie, Rysunek 1 przedstawia wydajność masy poczwarek od stycznia do czerwca 2010 roku. Wydajność mierzono dla poczwarek wzbogaconych w interesującym zakresie wielkości, 1,65-2,26 mm. Duża masa „wczesnych poczwarek” na początku roku wskazuje na wysoką proporcję muszek owocówek i niewyklutych poczwarek w tym czasie, gdy wprowadzano dostosowania w nowym obiekcie.

Rysunek 1. Wydajność wzbogaconych (średnica poczwarki 1,65-2,26 mm) wczesnych (bezpośrednio po selekcji wielkościowej) i „późnych” (po tygodniowym przechowywaniu i usunięciu pustych pochewek) poczwarek w kolonii F. ariasnus w ARS-USDA w Hilo na Hawajach, styczeń – czerwiec 2010

Dyskusja

W niniejszym protokole oraz towarzyszącym mu artykule wideo opisaliśmy i zaprezentowaliśmy zoptymalizowany protokół hodowli F. ariasnus, pasożyta muszek owocówek z rodziny Tephritidae, w warunkach laboratoryjnych. Protokół ten był udoskonalany przez lata w celu zminimalizowania nakładu pracy oraz amount specjalistycznego sprzętu niezbędnego do utrzymania kolonii. Zaznaczamy, że każda próba hodowli pasożytów wymaga dobrze ugruntowanej, produktywnej i stabilnej kolonii muszek owocówek pełniących rolę żywiciela. W naszym insektarium jako muszkę owocówkę-żywiciela wykorzystujemy Bactrocera dorsalis, choć wykazano, że inne gatunki również mogą być kompetentnymi żywicielami^14-17.

Kilka aspektów utrzymania kolonii F. arisanus wciąż wymaga zbadania. Należą do nich tempo adaptacji laboratoryjnej tego gatunku¹⁰, mechanizmy uczenia się²² oraz zmiany genetyczne, które mogą wystąpić podczas adaptacji, a także mechanizmy mogące wpływać na plastyczność muchowca w zależności od gospodarza.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat odnotowano wiele przykładów rozprzestrzeniania się muszek z podrodziny Dacinae na całym świecie, w szczególności gatunków z rodzaju Bactrocera: B. dorsalis w Polinezji Francuskiej, B. carambolae w częściach Ameryki Południowej, B. invadens w Afryce oraz B. zonata w Afryce i północnym basenie Morza Śródziemnego^3,23,18. Badanie skuteczności biologicznych czynników kontrolnych, takich jak F. arisanus, przeciwko innym gatunkom Bactrocera powinno być priorytetem. Mamy nadzieję, że zastosowanie metod opisanych w niniejszym protokole i towarzyszącym artykule wideo przyspieszy badania nad F. arisanus w szerszym zakresie lokalizacji²⁴. Wreszcie, dalsze badania z wykorzystaniem tej metody jako punktu wyjścia mogą dostarczyć istotnych informacji na temat kolonizacji nowych parazytoidów jaj^25,1