Fopius arisanus jest parasitoidem jaj i larw muszek owocówek z rodziny Tephritidae, który jest z sukcesem wykorzystywany w biologicznej kontroli tych istotnych tropikalnych szkodników. Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół hodowli F. arisanus na małą skalę z wykorzystaniem łatwo dostępnych materiałów.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowany protokół hodowli Fopius arisanus, parasytoida much owocówek z rodziny Tephritidae
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fopius arisanus (Sonan) jest istotnym parazytoidem muszek owocówek z rodziny Tephritidae z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, jest jednym z zaledwie trzech znanych parazytoidów z podrodziny Opiinae, które infekują gospodarza na etapie jaja1. Po drugie, posiada on szeroki zakres potencjalnych gospodarzy wśród muszek owocówek. Prawdopodobnie ze względu na cykl życiowy, F. arisanus był z powodzeniem stosowany w biologicznej walce z muszkami owocówkami w wielu regionach tropikalnych2-4. Jedną z przeszkód w szerokim zastosowaniu F. arisanus do zwalczania muszek owocówek jest trudność w stworzeniu stabilnej kolonii laboratoryjnej5-9. Mimo tych trudności, w latach 90. badacze z USDA opracowali niezawodną metodę utrzymywania populacji laboratoryjnych F. arisanus10-12. Istnieje znaczne zainteresowanie biologią F. arisanus13,14, szczególnie w odniesieniu do jego zdolności do kolonizacji szerokiej gamy gospodarzy z rodziny Tephritidae14-17; zainteresowanie to jest potęgowane przez niepokojące rozprzestrzenianie się szkodników z rodzaju Bactrocera na nowe kontynenty w ostatniej dekadzie18. Dalsze badania nad F. arisanus oraz dodatkowe wdrożenia tego gatunku jako czynnika biologicznej kontroli zyskają dzięki optymalizacji i ulepszeniu metod hodowli. W niniejszym protokole i powiązanym artykule wideo opisujemy zoptymalizowaną metodę hodowli F. arisanus opartą na wcześniej opisanym podejściu12. Opisana tutaj metoda pozwala na hodowlę F. arisanus na niewielką skalę bez użycia owoców, przy wykorzystaniu materiałów dostępnych w regionach tropikalnych na całym świecie i przy stosunkowo niskim nakładzie pracy ręcznej.
Protokół
1. Przygotowanie jaj muszki owocówki jako gospodarza do parasityzacji
- Przygotować podłoże dla jaj muszek owocówek przeznaczonych do zaparasytowania, przygotowując szalki wypełnione agarem (alternatywnie, bardziej ekonomiczną opcją jest Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ) o wymiarach 10 cm na bok i głębokości 1,5 cm. Agar przygotować w stężeniu 9 g na litr wody.
- Wypełnić szalki płynnym agarem aż do krawędzi (około 70 ml) i pozostawić do ostygnięcia i zestalenia (przez co najmniej 45 minut).
- Po zestaleniu bloków agaru, nałożyć pojedynczą warstwę ręcznika papierowego (jedna warstwa ręcznika z partii Georgia Pacific 'Preference'), pokrywając wierzch każdego bloku. Ręcznik powinien łatwo przylegać do agaru dzięki wilgoci powierzchniowej.
- Nanieść 0,5 ml zawiesiny jaj muszek owocówek w wodzie na powierzchnię bloków agaru pokrytą ręcznikiem. W naszym insekterium odpowiada to około 6000 jaj Bactrocera dorsalis (12000 jaj na ml).
- Użyć czystego pędzla o szerokości 2,5 cm zamoczonego w wodzie, aby równomiernie rozprowadzić jaja muszek owocówek po powierzchni ręcznika.
- Umieścić jaja muszek owocówek pod dolnym sitami klatek z parasytoidami, aby umożliwić składanie jaj. Opukać spód dolnego sita, aby usunąć martwe pasożyty, które mogłyby blokować dostęp do jaj. Najlepiej, aby dolne sito nie dotykało jaj.
- Pozostawić pasożyty do składania jaj przez noc i następnego dnia, łącznie przez około 21 godzin. Jest to czas wystarczający, aby zaparasytować wysoki odsetek jaj. Dłuższa ekspozycja wiąże się z ryzykiem superparasytyzacji.
2. Wyklucie i przepoczwarzenie zarażonych muszek owocówek
- Przygotować pojemnik hodowlany, umieszczając od 3 do 3,5 przygotowanych bloków agaru z zaparasytowanymi jajami na każde 1,25 litra pożywki dla muszek owocówek19, z jajami skierowanymi ku górze.
- Umieścić pojemnik z pożywką i jajami na podkładce nad warstwą drobnoziarnistego wermikulitu lub płukanego piasku o grubości 1,5 cm w większym pojemniku do przepocznienia. Przykryć pojemnik do przepocznienia pokrywką i zabezpieczyć krawędzie taśmą malarską. Wermikulit można wykorzystać ponownie po przesianiu (patrz poniżej).
- Upewnić się, że między górną krawędzią pojemnika z pożywką a pokrywą pojemnika do przepocznienia jest wystarczająco dużo miejsca, aby larwy muszki owocówki mogły wypełznąć i „wpaść»20 do znajdującego się poniżej wermikulitu.
- Przenieść pojemniki do przepocznienia do pomieszczenia o temperaturze 27°C i 80% wilgotności względnej (RH) na jeden tydzień. Przez pierwsze cztery dni przykryć pojemniki ciemną tkaniną, a następnie zdjąć ją na pozostałe dni.
- Usunąć pożywkę dla larw po tygodniu, gdy larwy opuszczają pożywkę i wnikną do wermikulitu w celu przepocznienia. Jeśli w wermikulicie znajdują się larwy, pozostawić je na noc do przepocznienia.
- Przesiać poczwarki z wermikulitu. Zacząć od sita o grubych oczkach (około 3 mm), a następnie użyć sita ręcznego, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki wermikulitu.
3. Sortowanie i selekcja
- Poczwarki zawierające F. arisanus można częściowo oddzielić od niezapasytuowanych muszek owocówek na podstawie ich wielkości. Należy zbierać poczwarki o średnicy od 1,65 do 2,26 mm, ponieważ w tej grupie będzie najwięcej zapasytuowanych much12. Puparia mniejsze zawierają głównie niedorozwinięte parasytoidy, natomiast większe poczwarki zawierają głównie muchy. Należy również zauważyć, że w przypadku zapasytuowanych poczwarek odsetek samic koreluje dodatnio z ich wielkością12.
- Do sortowania poczwarek według wielkości można zastosować różne metody. Opiszemy metodę mechaniczną z wykorzystaniem specjalnie skonstruowanego sortera wielkościowego21.
- Umieść poczwarki w lejku u góry podajnika wibracyjnego, który powoli zasila sorter wielkościowy.
- Podawaj poczwarki do sortera, który składa się z pary lekko rozbieżnych wałków ustawionych pod kątem 30°. Poczwarki wpadają pojedynczo, zależnie od rozmiaru, do szeregu szczelin, które poprzez lejek prowadzą do dziesięciu oddzielnych pojemników.
- Zbierz poczwarki z kubków w zakresie wielkości od 1,65 do 2,26 mm i umieść je w klatce wylęgowej na kolejne 7 dni, aż większość much wykluje się z niezapasytuowanych poczwarek.
- Następnie użyj wentylatora, aby oddzielić puste puparia od tych, które wciąż zawierają owady.
4. Wykluwanie i utrzymanie F. arisanus
- Do utrzymania kolonii F. arisanus należy użyć klatki do hodowli parazytoidów z wyjmowanym szklanym frontem, o długości boku około 25 cm. Klatka posiada siatkę o oczkach 1 mm2 na górze oraz na dwóch bokach. Tył klatki jest pokryty gumową płachtą z otworem o średnicy 9 cm służącym do dostępu. Dno klatki posiada wycięcie pokryte od wewnątrz siatką 1-2 mm2, wystarczająco duże, aby umożliwić umieszczenie dwóch bloków agaru z jajami muszki owocówki w celu zniesienia jaj przez parazytoida.
- Klatki powinny również posiadać przyciemnioną część wzdłuż dolnej ćwiartki szklanego frontu, aby zminimalizować dostęp światła, co może powodować gromadzenie się parazytoidów przy przedniej ścianie klatki, prowadząc do zwiększonej śmiertelności.
- Należy umieścić około 11 g wybranych poczwarek w plastikowych pojemnikach o średnicy około 9 cm. Powinno to dać około 600-700 parazytoidów na klatkę. Dobór rozmiaru powinien skutkować zawartością około 60% samic.
- Do pojemników należy przymocować siatkowe pokrywki. Pokrywki powinny być pokryte siatką 2 mm2, co pozwoli dorosłym osobnikom F. arsianus na opuszczenie pojemników po wyjściu z poczwarki, ale zatrzyma pozostałe muszki owocówki.
- Parazytoidy należy utrzymywać w temperaturze 24°C i wilgotności względnej RH około 45% przy fotoperiodzie 12:12 i dobrej wentylacji. W przypadku zaobserwowania wysokiej śmiertelności, można ją zmniejszyć, wynosząc klatki na zewnątrz na kilka godzin dziennie lub zwiększając wentylację. Parazytoidy powinny być gotowe do zniesienia jaj w ciągu kolejnego tygodnia i pozostawać produktywne przez dwa następne tygodnie.
- Należy nakładać nierozcieńczony miód wirowany wzdłuż górnej krawędzi klatek co najmniej trzy razy w tygodniu lub za każdym razem, gdy dostępny miód wyschnie. Miód wirowany należy nanosić w wąskich smugach za pomocą opuszka palca. Należy pamiętać, że jeśli smugi będą zbyt grube, miód będzie ściekać do wnętrza klatki; jeśli będą zbyt cienkie, miód szybko wyschnie i będzie wymagał częstego ponownego nakładania.
- Na górnych ściankach klatek należy umieścić bloki agaru (10 cm x 10 cm x 4 cm), aby zapewnić parazytoidom wilgoć. Powinny być one wymieniane dwa razy w tygodniu.
5. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszym raporcie przedstawiamy wyniki procedur kontroli jakości przeprowadzonych w hodowli F. arisanus USDA-ARS w Hilo na Hawajach w okresie od 5 stycznia do 22 czerwca 2010 roku. Hodowla w lokalizacji w Hilo w skali opisanej w tym artykule wideo i protokole została rozpoczęta w sierpniu 2009 roku, a początkowe problemy i korekty związane z nowym miejscem zostały w większości rozwiązane do stycznia. Zatem dane te są reprezentatywne dla wyników, jakie inni badacze mogliby uzyskać przy zakładaniu własnej kolonii, pod warunkiem przestrzegania opisanego protokołu oraz posiadania ogólnego doświadczenia w hodowli owadów. W tym okresie utrzymywaliśmy niewielką kolonię F. arisanus: w każdym tygodniu przygotowywano 4 klatki z pasożytami, co odpowiadało około 3600 osobników F. arisanus.
Wstępną kontrolę zwiększonych wskaźników parasitacji przeprowadzono, pobierając próbkę 2 g poczwarek o rozmiarach w zakresie 1,65 – 2,26 mm (wzbogacone) przed dodatkowym tygodniem rozwoju w klatce hodowlanej (tzn. bezpośrednio po usunięciu diety larwalnej oraz przesianiu i posegregowaniu poczwarek według rozmiaru. Określamy je mianem „wczesnych poczwerek”). W ciągu pierwszych trzech miesięcy 2010 roku średni udział pasożytów w próbce wzbogaconej wynosił 0,46 (SD=0,18). W kolejnym kwartale średnia ta wyniosła 0,58 (SD=0,08), co odzwierciedlało stabilizację kolonii i procedur hodowlanych w nowej lokalizacji. Należy zauważyć, że wzbogacone poczwarki, które nie zostały skutecznie sparazytowane, obejmują zarówno te, z których nie wykluły się osobniki, jak i te, z których wykluły się muchy.
Po dodatkowym tygodniu w klatce przechowawczej i usunięciu pustych pupariów pobrano kolejną próbkę o masie dwóch gramów („późne poczwarki”). Muszki owocówki stanowiły mniej niż 1% tej drugiej próbki. Niski odsetek muszek owocówek wynika częściowo z wcześniejszego wylotu much w porównaniu z pasożytami, w związku z czym większość much pozostała w pojemniku przechowawczym.
Na koniec, Rysunek 1 przedstawia wydajność w masie poczwerek od stycznia do czerwca 2010 roku. Wydajność mierzono dla poczwerek o rozmiarach w interesującym nas zakresie 1,65-2,26 mm. Duża masa „wczesnych poczwerek” na początku roku wskazuje na wysoki udział muszek owocówek i niewyklutych poczwerek w tym czasie, kiedy wprowadzano korekty w nowym obiekcie.
Rycina 1. Wydajność wzbogaconych (średnica poczek 1,65-2,26 mm) wczesnych (bezpośrednio po selekcji rozmiarów) i „późnych” (po tygodniowym przechowywaniu i usunięciu pustych pochewek) poczek w kolonii F. ariasnus ARS-USDA w Hilo na Hawajach, styczeń – czerwiec 2010
Dyskusja
W niniejszym protokole oraz towarzyszącym mu artykule wideo opisaliśmy i zaprezentowaliśmy zoptymalizowany protokół hodowli F. ariasnus, pasożyta muszek owocówek z rodziny Tephritidae, w warunkach laboratoryjnych. Protokół ten był udoskonalany przez lata w celu zminimalizowania nakładu pracy oraz amount specjalistycznego sprzętu niezbędnego do utrzymania kolonii. Zaznaczamy, że każda próba hodowli pasożytów wymaga dobrze ugruntowanej, produktywnej i stabilnej kolonii muszek owocówek pełniących rolę żywiciela. W naszym insektarium jako muszkę owocówkę-żywiciela wykorzystujemy Bactrocera dorsalis, choć wykazano, że inne gatunki również mogą być kompetentnymi żywicielami14-17.
Kilka aspektów utrzymania kolonii F. arisanus wciąż wymaga zbadania. Należą do nich tempo adaptacji laboratoryjnej tego gatunku10, mechanizmy uczenia się22 oraz zmiany genetyczne, które mogą wystąpić podczas adaptacji, a także mechanizmy mogące wpływać na plastyczność muchowca w zależności od gospodarza.
W ciągu ostatnich dziesięciu lat odnotowano wiele przykładów rozprzestrzeniania się muszek z podrodziny Dacinae na całym świecie, w szczególności gatunków z rodzaju Bactrocera: B. dorsalis w Polinezji Francuskiej, B. carambolae w częściach Ameryki Południowej, B. invadens w Afryce oraz B. zonata w Afryce i północnym basenie Morza Śródziemnego3,23,18. Badanie skuteczności biologicznych czynników kontrolnych, takich jak F. arisanus, przeciwko innym gatunkom Bactrocera powinno być priorytetem. Mamy nadzieję, że zastosowanie metod opisanych w niniejszym protokole i towarzyszącym artykule wideo przyspieszy badania nad F. arisanus w szerszym zakresie lokalizacji24. Wreszcie, dalsze badania z wykorzystaniem tej metody jako punktu wyjścia mogą dostarczyć istotnych informacji na temat kolonizacji nowych parazytoidów jaj25,1
Oświadczenia
Nie mamy do zgłoszenia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Keithowi Shigeteniemu za pomoc w insektarium oraz Natashy Sostrom za pomoc w zakresie grafiki komputerowej. Praca ta była finansowana przez USDA-ARS. Opinie, ustalenia, wnioski lub rekomendacje przedstawione w niniejszej publikacji są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy USDA. USDA jest dostawcą i pracodawcą zapewniającym równe szanse.
Bibliografia
- Wang, X. G., Bokonon-Ganta, A. H., Ramadan, M. M., Messing, R. H. Egg-larval opiine parasitoids (Hym., Braconidae) of tephritid fruit fly pests do not attack the flowerhead-feeder Trupanea dubautiae (Dipt., Tephritidae. Journal of Applied Entomology. 128, 716-722 (2004).
- Vargas, R. I. Potential for areawide integrated management of Mediterranean fruit fly (Diptera : Tephritidae) with a braconid parasitoid and a novel bait spray. Journal of Economic Entomology. 94, 817-825 (2001).
- Vargas, R. I., Leblanc, L., Putoa, R., Eitam, A. Impact of introduction of Bactrocera dorsalis (Diptera : Tephritidae) and classical biological control releases of Fopius arisanus (Hymenoptera : Braconidae) on economically important fruit flies in French Polynesia. Journal of Economic Entomology. 100, 670-679 (2007).
- Harris, E. J. Suppression of melon fly (Diptera: Tephritidae) populations with releases of Fopius arisanus and Psyttalia fletcheri (Hymenoptera Braconidae) in North Shore Oahu, HI, USA. Biocontrol. 55, 593-599 (2010).
- Haramoto, F. H. The Biology of Opius oophilus Fullaway (Hymenoptera: Braconidae) [dissertation]. , University of Hawaii. Honolulu, HI. (1988).
- Chong, M. Production methods for fruit fly parasites. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 18, 61-63 (1962).
- Snowball, G. J., Wilson, F., Lukins, R. G. Culture and consignment techiques used for parasites introduced against Queensland fruit fly (Strumeta tryoni (Frogg).). Australian Journal of Agricultural Research. 13, 233-248 (1962).
- Ramadan, M. M., Wong, T. T. Y., Beardsley, J. W. Reproductive Behavior of Biosteres arisanus (Sonan) (Hymenoptera:Braconidae), an Egg-Larval Parasitoid of the Oriental Fruit Fly. Biological Control. 2, 28-34 (1992).
- Ramadan, M. M., Wong, T. T. Y., McInnis, D. Reproductive biology of Biosteres arisanus (Sonan), an egg-larval parasitoid of the oriental fruit fly. Biological Control. 4, 93-100 (1994).
- Harris, E. J., Okamoto, R. Y. A Method for rearing Biosteres arisanus (Hymenoptera, Braconidae) in the laboratory. Journal of Economic Entomology. 84, 417-422 (1991).
- Bautista, R. C., Harris, E. J., Lawrence, P. O. Biology and rearing of the fruit fly parasitoid Biosteres arisanus: clues to insectary propagation. Entomologia Experimentalis Et Applicata. 89, 79-85 (1998).
- Bautista, R. C., Mochizuki, N., Spencer, J. P., Harris, E. J., Ichimura, D. M. Mass-rearing of the tephritid fruit fly parasitoid Fopius arisanus (Hymenoptera : Braconidae). Biological Control. 15, 137-144 (1999).
- Bautista, R. C., Harris, E. J., Vargas, R. I., Jang, E. B. Parasitization of melon fly (Diptera : Tephritidae) by Fopius arisanus and Psyttalia fletcheri (Hymenoptera : Braconidae) and the effect of fruit substrates on host preference by parasitoids. Biological Control. 30, 156-164 (2004).
- Rousse, P., Gourdon, F., Quilici, S. Host specificity of the egg pupal parasitoid Fopius arisanus (Hymenoptera : Braconidae) in La Reunion. Biological Control. 37, 284-290 (2006).
- Quimio, G. M., Walter, G. H. Host preference and host suitability in an egg-pupal fruit fly parasitoid, Fopius arisanus (Sonan) (Hym., Braconidae). Zeitschrift fur Angewandtes Entomologie. 125, 135-140 (2001).
- Calvitti, M., Antonelli, M., Moretti, R., Bautista, R. C. Oviposition response and development of the egg-pupal parasitoid Fopius arisanus on Bactrocera oleae, a tephritid fruit fly pest of olive in the Mediterranean basin. Entomologia Experimentalis Et Applicata. 102, 65-73 (2002).
- Montoya, P., Suarez, A., Lopez, F., Cancino, J. Fopius arisanus oviposition in four Anastrepha fruit fly species of economic importance in Mexico. Biocontrol. 54, 437-444 (2009).
- Vargas, R. I., Shelly, T. E., Leblanc, L., Piñero, J. C. Recent Advances in Methyl Eugenol and Cue-Lure Technologies for Fruit Fly Detection, Monitoring, and Control in Hawaii. Pheromones. 83, 575-595 (2010).
- Tanaka, N., Steiner, L. F., Ohinata, K., Okamoto, R. Low-cost larval rearing medium for mass production of oriental and Mediterranean fruit flies. Journal of Economic Entomology. 62, 967-968 (1969).
- Vargas, R. I. Mass production of tephritid fruit flies. World crop pests. Fruit flies: Their biology, natural enemies and control. 3, 141-151 (1989).
- Spencer, J. P., Mochizuki, N., McInnis, D. O., Liquido, N. J. Mechanical separation of parasitoid sexes based upon size of fruit fly host pupae. Abstracts of the 2nd meeting of the Working Group on Fruit Flies of the Western Hemisphere Vina Del Mar, Chile, , (1996).
- Dukas, R., Duan, J. J. Potential fitness consequences of associative learning in a parasitoid wasp. Behavioral Ecology. 11, 536-543 (2000).
- Drew, R., Tsuruta, K., White, I. A new species of pest fruit fly (Diptera: Tephritidae: Dacinae) from Sri Lanka and Africa. African Entomology. 13, 149-154 (2005).
- Argov, Y., Gazit, Y. Biological control of the Mediterranean fruit fly in Israel: Introduction and establishment of natural enemies. Biological Control. 46, 502-507 (2008).
- Bokonon-Ganta, A. H., Ramadan, M. M., Messing, R. H. Reproductive biology of Fopius ceratitivorus (Hymenoptera : Braconidae), an egg-larval parasitold of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae). Biological Control. 41, 361-367 (2007).
Przedruki i uprawnienia
