Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Podsumowanie

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Streszczenie

Sztywność macierzy silnie wpływa na wzrost, różnicowanie i funkcje komórek adherentnych^1-3. W skali makroskopowej sztywność tkanek i narządów w organizmie człowieka obejmuje kilka rzędów wielkości⁴. Znacznie mniej wiadomo o tym, jak sztywność zmienia się przestrzennie w obrębie tkanek oraz jaki jest zakres i skala przestrzenna zmian sztywności w procesach chorobowych prowadzących do przebudowy tkanki. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zmiany sztywności macierzy wpływają na fizjologię komórkową w zdrowiu i chorobie, konieczne są pomiary sztywności tkanek wykonane w skali przestrzennej istotnej dla komórek rezydentnych. Jest to szczególnie ważne w przypadku płuc, które są tkanką o wysokiej podatności i elastyczności, a przebudowa macierzy jest w nich wyraźną cechą w takich chorobach jak astma, rozedma, nadciśnienie i włóknienie. Aby scharakteryzować lokalne środowisko mechaniczne miąższu płuc w skali przestrzennej istotnej dla komórek rezydentnych, opracowaliśmy metody bezpośredniego pomiaru lokalnych właściwości sprężystych świeżej tkanki płuc myszy przy użyciu mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Przy odpowiednim doborze wgłębnika AFM, wspornika i głębokości indentacji, metody te umożliwiają pomiary lokalnego modułu ścinania tkanki równolegle z obrazowaniem kontrastowym fazowym i fluorescencyjnym badanego obszaru. Systematyczne pobieranie próbek z pasków tkankowych pozwala na stworzenie map właściwości mechanicznych tkanek, które ujawniają lokalne zmienności przestrzenne modułu ścinania. Korelacje między właściwościami mechanicznymi a podstawowymi cechami anatomicznymi i patologicznymi ilustrują, jak sztywność zmienia się wraz z odkładaniem macierzy we włóknieniu. Metody te można rozszerzyć na inne tkanki miękkie i procesy chorobowe, aby zbadać, jak lokalne właściwości mechaniczne tkanki zmieniają się w przestrzeni i wraz z postępem choroby.

Protokół

1. Przygotowanie pasków tkanki płucnej

1. Tkanka płucna charakteryzuje się wysoką podatnością, co utrudnia jej cięcie na paski do charakterystyki metodą AFM. Aby tymczasowo ustabilizować strukturę płuc w celu cięcia, należy napompować izolowane płuca myszy wewnątrztchawiczo 50 ml/kg masy ciała 2% agarozy o niskim punkcie żelowania (przygotowanej w PBS) podgrzanej do 37°C. Następnie należy zawiązać tchawicę i schłodzić napompowane płuca w kąpieli z PBS w temperaturze 4°C przez 60 minut. W tym czasie agaroza zgeliuje i stwardnieje w przestrzeniach powietrznych, delikatnie stabilizując strukturę płuc⁵. W celu dalszej poprawy stabilizacji tkanki podczas cięcia można zastosować wyższe stężenia agarozy, np. 3-4%.
2. Ustabilizowaną agarozą tkankę płuc myszy należy pociąć żyletką lub ostrzem skalpela na paski o długości i szerokości 5 x 5 mm oraz grubości 400 μm, a następnie przemyć paski w kąpieli z PBS wstępnie podgrzanej do 37°C, używając 100 ml szklanego zlewki na laboratoryjnej mieszadło-podgrzewaczu przez 5 minut, aby usunąć resztki agarozy. Aby wykluczyć duże drogi oddechowe i naczynia, paski należy wycinać z obszarów podpleuralnych, oddalonych od głównych oskrzeli. Jeśli planowane jest obrazowanie dróg oddechowych i dużych naczyń, paski należy wycinać z tkanki płucnej położonej bliżej głównych oskrzeli.

2. Mikrowgniecenie AFM i obrazowanie fluorescencyjne

1. Aby wyodrębnić obszary zainteresowania do mikroindentacji AFM, tkankę można wizualizować za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej lub poddać immunobarwieniu i wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku immunobarwienia, paski tkanki należy blokować 5% surowicą pochodzącą z gatunku, z którego pochodzi wymagane przeciwciało wtórne (w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, bez utrwalania i permeabilizacji.
2. Kawałek tkanki należy inkubować z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym (np. króliczym przeciwciałem anty-kolagen I w celu wizualizacji kolagenu śródmiąższowego (rozcieńczenie 1:250), lub króliczym przeciwciałem anty-laminina (rozcieńczenie 1:250) w celu wizualizacji błony podstawnej) w dołku płytki 12-dołkowej na kołysce przy łagodnym wstrząsaniu przez 1 godzinę; następnie próbkę należy przemyć 3 razy przez 5 minut każdorazowo w PBS, a następnie inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z markerem fluorescencyjnym (np. kozim przeciwciałem wtórnym anty-króliczym Alexa Fluor 546 (rozcieńczenie 1:250)) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Paski tkanki należy dokładnie przemyć PBS i przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C
4. Bezpośrednio przed charakterystyką AFM należy przymocować pasek tkanki do pokrywki szkiełkowa o średnicy 15 mm pokrytej poli-L-lizyną, podnosząc pokrywkę spod pływającej tkanki, upewniając się, że pasek tkanki rozłożył się równomiernie na powierzchni pokrywki; w razie potrzeby należy docisnąć pasek drugą, czystą, niepowlekaną pokrywką szkiełkową, wywierając lekki nacisk, aby wspomóc przyleganie tkanki do pokrywki pokrytej poli-L-lizyną.
5. System AFM należy skalibrować zgodnie z instrukcją producenta bezpośrednio przed każdą serią eksperymentów z mikroindentacją. Należy wyznaczyć dwa krytyczne parametry: 1) stałą sprężystości dźwigni (cantilever) metodą fluktuacji termicznych w powietrzu⁶; oraz 2) czułość ugięcia dźwigni, która jest parametrem służącym do przeliczenia sygnału wyjściowego fotodiody na rzeczywistą odległość ugięcia dźwigni, Δd. Czułość ugięcia kalibruje się poprzez uzyskanie standardowej krzywej siła-przemieszczenie w PBS na czystym szkiełku przedmiotowym, a następnie obliczenie nachylenia tej krzywej (Rys. 1B). Podczas pomiaru krzywej siła-przemieszczenie końcówka AFM jest wysuwana w stronę powierzchni próbki i cofana z jednego miejsca (bez skanowania w kierunkach X-Y), przy jednoczesnym monitorowaniu ugięcia dźwigni, Δd, jako funkcji przemieszczenia końcówki, Δz.

Zalecamy stosowanie trójkątnego wspornika z azotku krzemu z borokrzemianową końcówką sferyczną o średnicy 5-μm (Novascan). Wykorzystując sondy AFM o stałej sprężystości 0,06 N/m, przeprowadziliśmy charakterystykę mechaniczną miękkich materiałów o modułach ścinania w zakresie od 100 do 50 000 Pa.

6. Przetrzyj dolną powierzchnię szkiełka nakrywkowego z próbką za pomocą chusteczki papierowej, przymocuj je do standardnego szkiełka przedmiotowego za pomocą smaru próżniowego, zamocuj szkiełko przedmiotowe na stoliku AFM i pokryj tkankę 500 μl PBS (temperatura pokojowa).
7. Ustaw mikroskop do obserwacji przez okular, aby za pomocą regulacji stolika mikroskopowego wycentrować końcówkę AFM w polu widzenia. Wybierz interesujący obszar tkanki, poruszając stolikiem AFM, a następnie przełącz się na obrazowanie kamerą CCD, aby zarejestrować obraz w kontraście fazowym i/lub obrazy fluorescencyjne tkanki, zgodnie z potrzebami.
8. Wykonaj standardową operację zbliżania AFM, powoli przesuwając końcówkę AFM w dół, aż nawiąże ona kontakt z próbką.
9. Precyzyjna charakterystyka mikroindentacji próbek miękkich za pomocą AFM wymaga małych głębokości wcięcia, aby uniknąć dużych lokalnych odkształceń, które unieważniają model Hertza stosowany do obliczania modułu sprężystości. Aby uniknąć dużych odkształceń, wykonaj indentację w trybie wyzwalania (trigger mode), ustawiając maksymalne ugięcie dźwigni (punkt wyzwalania) na 500 nm. Ten limit ugięcia ograniczy maksymalną siłę wcięcia do wartości poniżej 30 nN (F = stała sprężystości dźwigni * przemieszczenie, lub F_max = 0,06 nN/nm * 500 nm = 30 nN).

Prędkość wciskania należy dobrać tak, aby była wystarczająco niska, by badać właściwości sprężyste, a nie wiskoelastyczne miękkiej próbki⁷. Dla tkanki płuc odpowiedni zakres prędkości wynosi 2-20 μm na sekundę.

10. W celu wykonania pojedynczego pomiaru w obszarze zainteresowania, przesuń sondę AFM w odpowiednie miejsce i wykonaj pojedynczą indentację, aby zarejestrować standardową krzywą siła-przemieszczenie (sonda porusza się wyłącznie w kierunku Z, bez skanowania w płaszczyźnie X-Y).
11. W celu zautomatyzowanego mapowania obszaru zainteresowania, przełącz urządzenie w tryb Force-Map, wybierz rozmiar skanu oraz punkty próbkowania w obrębie wybranego obszaru. W trybie Force-Map końcówka AFM przesuwa się rastrowo po powierzchni próbki pomiędzy ruchami indentacyjnymi, rejestrując poszczególne krzywe siła-przemieszczenie w każdym punkcie zdefiniowanej siatki pomiarowej. Większa liczba punktów próbkowania zapewni wyższą rozdzielczość przestrzenną, ale wydłuży czas mapowania. W praktyce zastosowanie siatki próbkowania 16 x 16 do zmapowania obszaru 80 x 80 μm przy prędkości indentacji 20 μm na sekundę pozwala na zakończenie pomiaru w czasie ~10 minut.

3. Ekstrakcja danych AFM

1. Aby obliczyć moduł Younga, dopasuj krzywą siła-przemieszczenie do modelu sferycznego wgniecenia Hertza, stosując nieliniową metodę dopasowania krzywej metodą najmniejszych kwadratów⁸ (Rys.1 A,C):
   
   gdzie F = k_c * Δd to siła ugięcia wspornika, k_c to stała sprężystości wspornika, R to promień sferycznej końcówki, δ = Δz - Δd to głębokość wgniecenia, a υ to liczba Poissona próbki (υ = 0.4 dla tkanki płucnej⁹).
2. Aby ocenić jakość dopasowania, oblicz wartość SSR, czyli sumę kwadratów różnic między danymi a wartościami dopasowanymi, podczas nieliniowego dopasowania krzywej. Wyeliminuj niewiarygodne lub nieinterpretowalne pomiary, odrzucając dane z „wadliwych” krzywych o wysokich wartościach SSR.
3. W razie potrzeby przekształć moduł sprężystości (E) w moduł ścinania (G), korzystając z zależności E = 2 x (1 + υ) x G. Aby zwizualizować przestrzenne wzorce sztywności zebrane w trybie Force-Map, przedstaw dane modułu na mapach konturowych (np. w siatce próbek 16 x 16 obejmującej obszar 80 x 80–μm).
4. Do przetwarzania dużej ilości danych z krzywych siły można napisać własny algorytm (np. w Matlab), który automatycznie dopasuje krzywe siła-przemieszczenie, wyznaczy moduły i/lub wygeneruje elastogramy, stosując te same procedury i parametry, które opisano w punktach 3.2 i 3.3.

Rycina 1 (A) Schemat mikroindentacji AFM miękkiej próbki na sztywnym podłożu z użyciem sondy sferycznej (Reprodukowano za zgodą Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J⁸). (B) Reprezentatywna krzywa siła-przemieszczenie zarejestrowana dla czystego szkiełka przedmiotowego w PBS w celu określenia czułości ugięcia dźwigara. (C) Reprezentatywne krzywe siła-przemieszczenie zarejestrowane dla próbek miękkich (niebieska) i sztywnych (czerwona), przedstawiające odpowiadające im parametry z (A).

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2A przedstawia pasek miąższu płuc przymocowany do szkiełka podstawowego pokrytego poli-L-lizyną w PBS, z sondą AFM umieszczoną bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, gotową do mapowania mikroindentacji. Rysunek 2B pokazuje, że w prawidłowo wyciętym i barwionym materiale tkankowym mikroarchitektura pęcherzykowa miąższu płuc jest dobrze zachowana, co zaobserwowano podczas barwienia immunofluorescencyjnego lamininy, składnika błony podstawnej, bez utrwalania i permeabilizacji. Rysunki 2C-D przedstawiają barwienie immunofluorescencyjne kolagenu I w świeżych, nieutrwalonych płucach pobranych od myszy, które wcześniej otrzymywały PBS (Rys. 2C) lub bleomycynę (Rys. 2D) w celu wywołania włóknienia¹⁰.

Rysunek 3A przedstawia przykładowe wykresy siła-przemieszczenie uzyskane za pomocą mikroindentacji AFM. Przy tej samej sile przyłożonej, końcówka AFM generuje duże wgłębienie w miękkim obszarze (linia niebieska), co skutkuje stosunkowo „płaską” krzywą siła-przemieszczenie, w przeciwieństwie do małego wgłębienia i „stromej” krzywej siła-przemieszczenie dla obszaru sztywniejszego (linia czerwona). Aby uzyskać czyste krzywe siły, po każdym wgnieceniu końcówka AFM musi zostać całkowicie wycofana z powierzchni próbki i znajdować się poza kontaktem przed kolejną indentacją. Ten stan bezkontaktowy odpowiada płaskiemu obszarowi krzywej na Rysunku 3A, gdzie końcówka przemieszcza się bez ugięcia dźwigara. Rysunek 3B pokazuje typową błędną krzywą bez obszaru płaskiego, która występuje, gdy końcówka nie zostanie całkowicie wycofana z powierzchni próbki (np. miękka próbka przylega do końcówki), co uniemożliwia określenie punktu kontaktu. Jeśli końcówka zostanie całkowicie uwięziona w miękkiej próbce, krzywa może wyglądać jak na Rysunku 3C, bez wyraźnego ugięcia, lecz z niewielkim szumem.

Rysunek 4 przedstawia dane dotyczące modułu ścinania wyekstrahowane z krzywych siła-przemieszczenie, wyświetlone przestrzennie jako mapy sztywności (elastogramy), gdzie kolor odpowiada wartości modułu ścinania. Elastogramy wykazują uderzające różnice w zakresie i rozkładzie modułu ścinania tkanki w prawidłowym (Rys. 4A) oraz zwłókniałym (Rys. 4B) miąższu płuc, a także duże wariacje przestrzenne modułu ścinania, szczególnie w próbce zwłókniałego płuca.

Rycina 2. (A) Mikrofotografia w kontraście fazowym przedstawiająca sondę AFM nad paskiem miąższu płuca myszy. Pasek skali, 50 μm. (B) Immunobarwienie lamininy w prawidłowej tkance płucnej myszy, ukazujące mikroarchitekturę pęcherzykową prawidłowego miąższu płucnego. Biała ramka wskazuje typowy obszar mapowania elastyczności o wymiarach 80-by-80μm. Pasek skali: 20 μm. (C i D) Immunobarwienie kolagenu I w miąższu płucnym myszy traktowanym solą fizjologiczną (C) oraz bleomycyną (D). Paski skali, 100 μm.

Rysunek 3. (A) Reprezentatywne, możliwe do zinterpretowania krzywe siła-przemieszczenie uzyskane odpowiednio z miąższu płuc myszy traktowanych solą fizjologiczną (niebieski) oraz bleomycyną (czerwony). Linie czarne stanowią najlepsze dopasowanie wynikające z modelu sferycznego Hertza i są opisane odpowiadającymi im obliczonym modułami Younga. (B, C) Reprezentatywne, niemożliwe do zinterpretowania krzywe siła-przemieszczenie.

Rysunek 4. Reprezentatywne elastogramy pobrane z miąższu płuc myszy traktowanych soli fizjologicznej (A) oraz bleomycyną (B). Paski kolorów wskazują moduł ścinania w kilopaskalach. Etykiety osi wskazują skalę przestrzenną w mikrometrach. Pasek skali: 20 μm

Dyskusja

Charakterystyka mechaniczna tkanki płucnej z wykorzystaniem mikroindentacji AFM oferuje bezprecedensową rozdzielczość przestrzenną (Rys. 4), zapewniając unikalny wgląd w mikroskalowe zmienności sztywności tkanki. Jako przykład jej użyteczności, wcześniejsze pomiary w skali makro w paskach prawidłowej i włóknistej tkanki płucnej wykazały około 2-3-krotny wzrost elastancji w przypadku włóknienia^11,12. W przeciwieństwie do tego, mikroindentacja AFM ujawnia, że utwardzenie tkanki jest silnie zlokalizowane, a niektóre obszary wykazują nawet ~30-krotny wzrost modułu ścinania powyżej mediany obserwowanej w prawidłowej tkance płucnej¹⁰. Ponieważ wiadomo obecnie, że sztywność macierzy ma krytyczny wpływ na funkcje komórkowe, te lokalne pomiary dostarczają nieocenionych parametrów pozwalających zwiększyć biofidelity badań hodowli komórek płucnych.

Przy zastosowaniu cienkich pasków tkanki płucnej pojawia się kilka problemów praktycznych. Powierzchnie pasków nie są idealnie płaskie, ponieważ profil tkanki odzwierciedla architekturę leżących u podstawy pęcherzyków płucnych. System AFM automatycznie koryguje pozycję sondy w kierunku Z podczas indentacji, gdy zmienność wysokości powierzchni próbki jest mniejsza niż 15-μm, co pomaga zniwelować to utrudnienie. Pomiary są wykonywane w temperaturze pokojowej, a nie w 37°C, zatem nie można ocenić odchyleń właściwości mechanicznych spowodowanych tą różnicą temperatur, choć można oczekiwać, że będą one niewielkie. Wpływ architektury ściany pęcherzyka płucnego na obserwowane właściwości mechaniczne jest trudny do określenia przy użyciu obecnego układu mikroskopii świetlnej. Na przykład pożądane byłoby ustalenie, czy ściany pęcherzyków wykazują anizotropię i różne właściwości mechaniczne podczas indentacji w kierunkach równoległych lub prostopadłych do płaszczyzny ściany. Jednakże obecne preparaty są grube, a system obrazowania nie posiada możliwości obrazowania 3D, w związku z czym nie jest możliwe określenie lokalnej orientacji ściany pęcherzyka w każdym punkcie styku. Wreszcie, wpływ składników komórkowych na mierzone właściwości mechaniczne wymaga pełnego wyjaśnienia. W metodach opisanych w niniejszej pracy nie podjęto prób specyficznego usuwania składników komórkowych tkanki. Jednakże komórki obecne na powierzchni dostępnej do indentacji prawdopodobnie nie są żywe, biorąc pod uwagę czas, jaki upłynął od pobrania tkanki, oraz konieczność jej przecięcia w celu uzyskania dostępu do pęcherzyków. Wskazane wydaje się przeprowadzenie specyficznych eksperymentów mających na celu usunięcie komórek lub ponowne zasiedlenie macierzy żywymi komórkami oraz ocenę wynikających z tego zmian sztywności tkanki.

Ponieważ do tych pomiarów wymagana jest świeża, niefiksowana tkanka, czas od pobrania tkanki do pomiaru powinien być zminimalizowany, a próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zmian właściwości mechanicznych. Szczególną uwagę należy zachować podczas przenoszenia pasków tkanki między naczyniami podczas przemywania lub barwienia, aby zminimalizować ryzyko deformacji lub uszkodzenia. W przypadku zastosowania AFM w cieczy kluczowym krokiem jest jak najbardziej płaskie wycięcie tkanki i unieruchomienie próbki na szkiełku podstawowym. Jeśli jest dostępny, do wycinania plastrów o bardzo jednolitej grubości można użyć zautomatyzowanej maszyny do sekcjonowania, takiej jak wibratom lub slicer do tkanek. Ważne jest, aby przymocować paski tkanki bezpośrednio przed pomiarami AFM i zminimalizować czas trwania tych pomiarów, ponieważ próbka z czasem odklei się od szkiełek. Przydatną obserwacją jest to, że większe paski wydają się przylegać stabilniej do szkiełek i pozostawać na swoim miejscu w PBS przez dłuższy czas niż paski mniejsze.

Mikroindentacja AFM może charakteryzować próbki w szerokim zakresie od 100 Pa do 50 kPa (moduł ścinania) przy użyciu standardowej dźwigni o stałej 0,06 N/m z kulistą końcówką o średnicy 5 μm. Zakres ten można rozszerzyć, stosując sondy o różnych stałych sprężystości; dostępne są komercyjnie (np. Novascan) i powszechnie stosowane sondy AFM z kulistymi szklanymi końcówkami o średnicach od 0,6 do 12 μm i stałych sprężystości od 0,01 do 0,58 N/m³. Przy zastosowaniu kulistej końcówki o średnicy 5 μm teoretyczna powierzchnia kontaktu między końcówką a tkanką wynosi około 5-9 μm² dla indentacji o głębokości 400-700 nm (Rys. 1A). Do zapewnienia mniejszej lub większej rozdzielczości przestrzennej można użyć mniejszych lub większych końcówek. W mikroindentacji AFM stosowano również końcówki piramidalne^13-16, które zapewniają mniejszą powierzchnię kontaktu, zwiększając tym samym rozdzielczość przestrzenną mapowania, choć dopasowanie danych dla tej geometrii końcówki jest bardziej złożone.

Należy odnotować kilka ograniczeń tej metody. Płuca tradycyjnie charakteryzowano mechanicznie w sposób nieinwazyjny, na przykład za pomocą analizy ciśnienie-objętość¹⁷ lub wkluwania (punch-indentation) całych płuc^19,20. Metody inwazyjne, takie jak opisana tutaj, zmieniają architekturę płuc w istotny sposób poprzez utratę granicy powietrze-ciecz, która normalnie występuje w wypełnionych powietrzem płucach, oraz utratę wstępnego naprężenia, które utrzymuje częściowe nadmuchanie płuc po rozluźnieniu mięśni oddechowych. Ograniczenia te są wspólne dla wszystkich pomiarów wykonywanych na paskach tkanki płucnej¹⁸. Co istotne, mediana sztywności zmierzona w miąższu prawidłowej tkanki płucnej (moduł ścinania ~0.5kPa) nie różni się znacząco od szacunków opartych na wkluwaniu nienaruszonych płuc przy objętościach spoczynkowych^19,20. Choć wiadomo, że tkanka płucna wykazuje nieliniowy wzrost sztywności wraz ze zwiększającą się deformacją, przy zastosowaniu tutaj metod nie jest możliwe rygorystyczne sprawdzenie, czy właściwość ta utrzymuje się w skali mikro. Model Hertza zakłada jednorodność próbki. Jednak większość materiałów biologicznych, w tym miąższ płucny, wykazuje coraz większą niejednorodność w miarę zmniejszania skali przestrzennej. Niejednorodność próbki może prowadzić do wystąpienia artefaktów, takich jak zmienność modułu Younga w zależności od głębokości wkluwania, tzn. w zależności od odkształcanej warstwy lub komponentu. Niejednorodność w płaszczyźnie xy można ograniczyć poprzez staranny dobór odpowiedniej wielkości sferycznej końcówki w zależności od mikrostruktury biomateriału, zgodnie z propozycją Dimitriadisa EK et al.⁸ Znacznie trudniej jest przewidzieć lub skorygować błąd modelu Hertza wynikający z niejednorodności materiału w kierunku z. Azeloglu i współpracownicy zaproponowali niedawno hybrydowy model obliczeniowy do charakteryzacji właściwości elastycznych niejednorodnego podłoża z dyskretnymi wtrąceniami²¹. Ich nowa technika stanowi potencjalny sposób obliczania właściwości wtrąceń w materiałach niejednorodnych, co pozwala przełamać ograniczenia analizy hertzowskiej.

Model Hertza zakłada również całkowicie sprężyste zachowanie, podczas gdy materiały biologiczne zazwyczaj wykazują zależne od czasu właściwości wiskoelastyczne. Pełną charakterystykę wiskoelastyczną tkanki można uzyskać poprzez zmianę stosowanych prędkości wgłębiania. Co istotne, wcześniejsze badania mechaniczne w skali makroskopowej normalnej i zwłókniałej tkanki płuc wykazują słabą zależność od częstotliwości właściwości mechanicznych tkanki płucnej oraz zachowanie różnic między właściwościami mechanicznymi tkanki normalnej i zwłókniałej we wszystkich badanych częstotliwościach¹¹. Wyniki te silnie sugerują, że pomiar właściwości mechanicznych przy użyciu pojedynczej prędkości wgłębiania za pomocą AFM pozwala uchwycić kluczowy aspekt zmian w właściwościach mechanicznych tkanki towarzyszących włóknieniu.

Współczynnik Poissona wynoszący 0,4 dla tkanki płucnej wykorzystanej w niniejszej pracy pochodzi z pomiaru makroskopowego⁹. Niestety w literaturze nie ma dostępnych danych na temat współczynnika Poissona w skali mikro ani żadnych zmian zachodzących w warunkach chorobowych. Jako alternatywy dla E można obliczyć z mikroindentacji AFM i raportować E/(1-υ²) lub (1-υ²)/πE (oznaczony jako stała sprężystości k)²² w przypadku, gdy współczynnik Poissona jest nieznany. Dla większości biomateriałów współczynnik Poissona mieści się w zakresie od 0,4 do 0,5 ze względu na ich wysoką zawartość wody. W zakresie 0,3-0,5 czynnik 1/(1-υ²) zmienia się jedynie od 1,10 do 1,33, co oznacza, że uzasadnione wahania współczynnika Poissona wywierają jedynie niewielki wpływ na raportowany moduł. Wzrost modułu ścinania, który zgłaszamy dla tkanki zwłókniałej w stosunku do tkanki prawidłowej, jest kilkukrotnie większy, co sugeruje, że błędy związane ze zmiennością współczynnika Poissona są niewielkie w porównaniu do zaobserwowanych zmian właściwości mechanicznych.

Rzeczywisty algorytm i kod, które mogą zostać wykorzystane do analizy danych siła-przemieszczenie, zależą od konkretnych warunków zastosowania oraz późniejszych charakterystyk zróżnicowanych populacji krzywych siła-przemieszczenie. W przypadku zainteresowania bardziej zaawansowaną analizą można zapoznać się z pracą Lin i wsp.²³. Autorzy ci opracowali szereg synergistycznych strategii w ramach algorytmu, który eliminuje wiele komplikacji, które wcześniej utrudniały próby automatyzacji dopasowania modeli Hertza do danych z indentacji.

Istnieje kilka innych obszarów dostępnych do dalszego rozwoju i wykorzystania tej metody. W przypadkach, gdy celem jest wizualizacja ścian pęcherzyków płucnych bez znakowania przeciwciałami, zarówno elastynę, jak i kolagen można zwizualizować na podstawie ich sygnału autofluorescencyjnego w spektrum zielonym. Z drugiej strony, lepsze obrazowanie, z wykorzystaniem cieńszych przekrojów tkanki, technik obrazowania 3D lub obu tych rozwiązań, mogłoby zwiększyć możliwość korelacji architektury tkanki z podstawowymi właściwościami mechanicznymi. Choć obecne metody pozwalają na barwienie i wizualizację składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen i laminina, dodatkowe wysiłki można skierować na barwienie markerów powierzchniowych komórek w celu identyfikacji specyficznych populacji komórkowych i charakterystyki mechanicznych mikrośrodowisk w sąsiedztwie takich populacji. Alternatywnie, w celu osiągnięcia tego samego celu można by pobrać tkankę od myszy wykazujących ekspresję markerów linii komórkowych lub białek specyficznych dla komórek znakowanych fluorescencyjnie. Wreszcie, opisana tutaj metoda wydaje się dobrze dostosowana do charakterystyki innych cech anatomicznych płuc, takich jak naczynia przechodzące przebudowę w nadciśnieniu oraz drogi oddechowe przebudowujące się w astmie. Biorąc pod uwagę obecny stan rozwoju i potencjał do dalszego ulepszania, mikroindentacja AFM wydaje się być gotowa do dostarczenia cennych informacji na temat zmian sztywności tkanki towarzyszących progresji chorób płuc i bez wątpienia będzie wartościowa w charakterystyce przestrzennych i czasowych zmian sztywności wielu innych tkanek miękkich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Grot AFM	Novascan Technologies, Inc.	PT.GS	Kuleczka borokrzemianowa 5 micron, 0.06 N/m
Kryszalki z poli-L-lizyną	VWR international	354085	BD BioCoat, okrągłe szkło 12 mm nr 1
Agaroza o niskiej temperaturze żelowania	Sigma-Aldrich	A0701
Królicze przeciwciało anty-kolagen I (Rb pAb)	Abcam	ab34710-100
Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
Królicze przeciwciało anty-laminina	Sigma-Aldrich	L9393