Charakterystyka mikromechaniczna tkanki płucnej przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Summary

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wielorakie zachowania przylegających komórek. Sztywność matrycy zmienia się przestrzennie w tkance i ulega modyfikacji w różnych stanach chorobowych. Tutaj opracowujemy metody charakteryzowania przestrzennych zmian sztywności w normalnej i zwłóknienionej tkance płucnej myszy za pomocą mikrowgłębienia mikroskopii sił atomowych.

Abstract

Sztywność matrycy silnie wpływa na wzrost, różnicowanie i funkcję przylegających komórek^1-3. W skali makro sztywność tkanek i narządów w ludzkim ciele rozciąga się na kilka rzędów wielkości⁴. Znacznie mniej wiadomo o tym, jak sztywność zmienia się przestrzennie w obrębie tkanek oraz jaki jest zakres i skala przestrzenna zmian sztywności w procesach chorobowych, które skutkują przebudową tkanek. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zmiany sztywności macierzy przyczyniają się do fizjologii komórkowej w zdrowiu i chorobie, potrzebne są pomiary sztywności tkanek uzyskane w skali przestrzennej odpowiedniej dla komórek rezydentnych. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku płuc, wysoce podatnej i elastycznej tkanki, w której przebudowa macierzy jest istotną cechą w chorobach takich jak astma, rozedma płuc, nadciśnienie i zwłóknienie. Aby scharakteryzować lokalne środowisko mechaniczne miąższu płuc w skali przestrzennej istotnej dla komórek rezydentnych, opracowaliśmy metody bezpośredniego pomiaru lokalnych właściwości elastycznych świeżej mysiej tkanki płucnej za pomocą mikrotwardości mikroskopii sił atomowych (AFM). Przy odpowiednim doborze wgłębnika AFM, wspornika i głębokości wgłębienia, metody te umożliwiają pomiary lokalnego modułu ścinania tkanek równolegle z kontrastem fazowym i obrazowaniem fluorescencyjnym obszaru zainteresowania. Systematyczne pobieranie próbek pasków tkanek dostarcza map właściwości mechanicznych tkanek, które ujawniają lokalne przestrzenne różnice modułu ścinania. Korelacje między właściwościami mechanicznymi a podstawowymi cechami anatomicznymi i patologicznymi ilustrują, jak sztywność zmienia się wraz z odkładaniem się macierzy w zwłóknieniu. Metody te można rozszerzyć na inne tkanki miękkie i procesy chorobowe, aby ujawnić, jak lokalne właściwości mechaniczne tkanek różnią się w zależności od przestrzeni i postępu choroby.

Protocol

1. Przygotowanie paska tkanki płucnej

1. Tkanka płucna jest wysoce podatna i trudna do pocięcia na paski w celu scharakteryzowania AFM. Aby przejściowo ustabilizować strukturę płuc do cięcia, należy napompować izolowane płuca myszy dotchawiczo 50 ml/kg masy ciała 2% agarozy o niskiej temperaturze żelu (przygotowanej w PBS) ogrzanej do 37°C. Związać tchawicę i schłodzić napełnione płuca w kąpieli PBS o temperaturze 4°C przez 60 minut. Agaroza żeluje się i sztywnieje w przestrzeniach powietrznych, aby delikatnie ustabilizować strukturę płuc w tym okresie⁵. Wyższe stężenia agarozy, tj. 3-4%, mogą być wykorzystane do dalszego wzmocnienia stabilizacji tkanek do cięcia.
2. Stabilizowaną agarozą tkankę płucną myszy pokroić żyletką lub skalpelem na paski o długości i szerokości 5 x 5 mm oraz grubości 400 μm, a następnie umyć paski w kąpieli PBS podgrzanej do temperatury 37°C za pomocą szklanej zlewki o pojemności 100 ml na podgrzewanej płycie mieszającej przez 5 minut, aby usunąć resztki agarozy. Aby wykluczyć duże drogi oddechowe i naczynia, odetnij paski z obszarów podopłucnowych odległych od głównych oskrzeli łodygi. Jeśli mają być zobrazowane drogi oddechowe i duże naczynia, należy wyciąć paski z tkanki płucnej bardziej proksymalnie do oskrzeli głównej łodygi.

2. Mikrotwardość AFM i obrazowanie fluorescencyjne

1. Aby wyizolować obszary zainteresowania dla mikropigmentacji AFM, tkankę można uwidocznić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym lub wybarwić immunologicznie i uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu barwienia immunologicznego należy zablokować paski tkankowe 5% surowicą ze źródła pożądanego przeciwciała wtórnego (w PBS) przez 2 godziny bez utrwalania lub przepuszczalności w temperaturze pokojowej.
2. Inkubować pasek tkanki z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym (np. antykolagenem królika I w celu wizualizacji kolagenu śródmiąższowego (rozcieńczenie 1:250), antylamininą królika (rozcieńczenie 1:250) w celu uwidocznienia błony podstawnej) w studzience 12-dołkowej płytki na kołysce z delikatnym wstrząsaniem przez 1 godzinę, przemywać próbkę 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS, a następnie odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego ze znacznikiem fluorescencyjnym (np. kozie przeciwciało przeciw królikowi przeciw koziej kwasie przeciw królikowi (rozcieńczenie 1:250)) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Dokładnie umyć paski tkanek PBS i przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C
4. Bezpośrednio przed charakterystyką AFM przymocować pasek tkanki do 15-milimetrowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-l-lizyną, podnosząc szkiełko nakrywkowe spod pływającej tkanki, upewniając się, że pasek tkanki równomiernie rozprowadza się na powierzchni szkiełka nakrywkowego; jeśli to konieczne, należy umieścić pasek z drugim czystym, niepowlekanym szkiełkiem nakrywkowym i lekko docisnąć, aby pomóc w przyczepieniu tkanki do szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-l-lizyną.
5. Kalibruj system AFM zgodnie z instrukcjami producenta bezpośrednio przed każdą rundą eksperymentów z mikrotwardością. Określ dwa krytyczne parametry: 1) stałą sprężystości wspornikowej metodą fluktuacji termicznej w powietrzu⁶; oraz 2) czułość ugięcia wspornika, która jest parametrem używanym do skalowania sygnału wyjściowego fotodiody do rzeczywistej odległości ugięcia wspornika, Δd. Skalibruj czułość ugięcia, uzyskując standardową krzywą siła-przemieszczenie w PBS na czystym szkiełku, a następnie oblicz nachylenie krzywej siła-przemieszczenie (rys. 1B). W pomiarze krzywej siła-przemieszczenie końcówka AFM jest wysuwana w kierunku powierzchni próbki i cofana od niej w jednym miejscu (bez rastrowania w kierunkach X-Y), przy czym ugięcie wspornika, Δd, jest monitorowane w funkcji przemieszczenia końcówki, Δz.

Zalecamy użycie trójkątnego wspornika z azotku krzemu z kulistą końcówką borokrzemianową o średnicy 5 μm (Novascan). Za pomocą sond AFM o stałej sprężystości 0,06 N/m scharakteryzowaliśmy mechanicznie miękkie materiały o modułach ścinania w zakresie od 100 do 50 000 Pa.

6. Przetrzyj dolną powierzchnię szkiełka nakrywkowego z próbką bibułą, przymocuj ją do standardowego szkiełka za pomocą smaru próżniowego, zamontuj szkiełko na stoliku na próbkę AFM i przykryj chusteczkę 500 μl PBS (temperatura pokojowa).
7. Ustaw mikroskop do okularu view, aby wyrównać końcówkę AFM w środku pola view, regulując stolik na próbki mikroskopu. Wybierz obszar zainteresowania na tkance, przesuwając stolik na próbkę AFM, a następnie przełącz się na kamerę CCD view, aby zarejestrować obraz kontrastu fazowego i/lub obrazy fluorescencyjne tkanki, zgodnie z potrzebami.
8. Wykonaj standardową operację załączania AFM, przesuwając powoli końcówkę AFM w dół, aż zetknie się z sample.
9. Dokładna charakterystyka mikrotwardości AFM miękkich próbek wymaga małych głębokości wgłębień, aby uniknąć dużych lokalnych odkształceń, które unieważniają model Hertza używany do obliczania modułu sprężystości. Aby uniknąć dużych odkształceń, wykonaj wgłębienie w trybie wyzwalania, ustawiając maksymalne ugięcie wspornika (punkt spustu) na 500 nm. Ta granica ugięcia ograniczy maksymalną siłę wgniecenia do mniej niż 30 nN (F = stała sprężystości wspornikowej * przemieszczenie lub F_max = 0,06 nN/nm * 500 nm = 30 nN).

Prędkość wgłębienia powinna być wybrana tak, aby była wystarczająco wolna, aby zbadać elastyczne, a nie lepkosprężyste właściwości miękkiej próbki⁷ . Zakres prędkości 2-20 μm na sekundę jest odpowiedni dla tkanki płucnej.

10. Aby wykonać pojedynczy pomiar z obszaru zainteresowania, przesuń sondę AFM w interesujące Cię miejsce i wykonaj pojedyncze wgłębienie, aby uzyskać standardową krzywą siła-przemieszczenie (sonda porusza się tylko w kierunku Z bez skanowania X-Y).
11. Aby automatycznie zmapować obszar zainteresowania, przełącz się w tryb Force-Map, wybierz rozmiar skanowania i punkty próbkowania w wybranym obszarze. W trybie Force-Map końcówka AFM rastruje w poprzek powierzchni próbki między ruchami wgłębień i zbiera indywidualne krzywe siła-przemieszczenie w każdym punkcie w zdefiniowanej siatce próbki. Więcej punktów próbkowania zapewni wyższą rozdzielczość przestrzenną, ale wydłuży czas potrzebny na mapowanie. Uznaliśmy, że praktyczne jest użycie siatki próbek 16 x 16 do mapowania obszaru o wymiarach 80 x 80–μm z prędkością wgłębienia 20 μm na sekundę, co można wykonać w ~10 minut.

3. Ekstrakcja danych AFM

1. Aby obliczyć moduł Younga, dopasuj krzywą siła-przemieszczenie do modelu wcięcia sferycznego Hertza za pomocą nieliniowego dopasowania krzywizny^metodą najmniejszych kwadratów 8 (rys. 1 A,C):
   
   gdzie F = k_c * Δd, jest siłą potrzebną do zgięcia wspornika, k_c jest stałą sprężystości wspornika, R jest promieniem końcówki kuli, δ = Δz - Δd jest wcięciem, a υ jest wcięciem próbki Współczynnik Poissona (υ = 0,4 dla tkanki płucnej⁹).
2. Aby ocenić jakość dopasowania, należy obliczyć wartość SSR lub sumę kwadratów różnicy między danymi a wartościami dopasowania podczas dopasowania krzywej nieliniowej. Wyeliminuj niewiarygodne lub niemożliwe do zinterpretowania pomiary, odrzucając dane z "złych" krzywych o dużych wartościach SSR.
3. W razie potrzeby przekształć moduł sprężystości (E) na moduł ścinania (G), używając zależności E = 2 x (1 + υ) x G. Aby zobrazować przestrzenne wzorce sztywności zebrane w trybie Force-Map, należy wykreślić dane modułu na mapach konturowych (np. w siatce próbek 16 x 16 obejmującej obszar 80 x 80–μm).
4. Aby przetworzyć dużą ilość danych dotyczących krzywej siły, można napisać niestandardowy algorytm, który automatycznie dopasowuje krzywe siła-przemieszczenie, wyodrębnia moduły i/lub wykreśla elastogramy przy użyciu tych samych procedur i parametrów, jak opisano w 3.2 i 3.3 (np. Matlab).

Rysunek 1 (A) Schemat mikrowgłębienia AFM miękkiej próbki na sztywnym podłożu za pomocą sondy sferycznej (odtworzony za zgodą Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J⁸). (B) Reprezentatywna krzywa siła-przemieszczenie pobrana z czystego szkiełka w PBS w celu określenia wrażliwości na ugięcie wspornika. (C) Reprezentatywne krzywe siła-przemieszczenie zebrane z próbek miękkich (niebieskich) i sztywnych (czerwonych), przedstawiające odpowiednie parametry z (A).

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 2A pokazuje pasek miąższu płuc przymocowany do szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-l-lizyną w PBS z sondą AFM umieszczoną bezpośrednio nad obszarem zainteresowania i gotową do mapowania mikrowgłębień. Rycina 2B pokazuje, że w prawidłowo pociętej i wybarwionej tkance mikroarchitektura pęcherzyków płucnych miąższu płuc jest dobrze zachowana, co obserwuje się za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lamininy składnika błony podstawnej bez utrwalenia lub przepuszczalności. Rycina 2 C-D pokazuje barwienie immunofluorescencyjne kolagenu I w świeżych, nieutrwalonych płucach pobranych od myszy wcześniej leczonych PBS (ryc. 2C) lub leczonych bleomycyną (ryc. 2D) w celu wywołania zwłóknienia¹⁰.

Rysunek 3A pokazuje przykładowe wykresy siły i przemieszczenia uzyskane z mikrowgłębienia AFM. Przy tej samej przyłożonej sile końcówka AFM generuje duże wgłębienie w miękkim obszarze (niebieska linia), co skutkuje stosunkowo "płaską" krzywą siła-przemieszczenie w porównaniu z małym wgłębieniem i "stromą" krzywą siła-przemieszczenie dla sztywniejszego obszaru (czerwona linia). Aby uzyskać czyste krzywe siły, po każdym wgłębieniu końcówka AFM musi być całkowicie cofnięta od powierzchni próbki i wolna od kontaktu przed następnym wgłębieniem. Ten stan bezkontaktowy odpowiada płaskiemu obszarowi krzywej na rysunku 3A, w którym końcówka przesuwa się bez ugięcia wspornika. Rysunek 3B przedstawia typową fałszywą krzywą bez płaskiego obszaru, która występuje, gdy końcówka nie jest całkowicie cofnięta od powierzchni próbki (np. miękka próbka przyczepia się do końcówki), co uniemożliwia określenie punktu kontaktu. Jeśli końcówka jest całkowicie uwięziona w miękkiej próbce, krzywa może wyglądać tak, jak pokazano na rysunku 3C, bez wyraźnego ugięcia, ale z niewielkim szumem.

Rysunek 4 pokazuje dane modułu ścinania wyodrębnione z krzywych siła-przemieszczenie wyświetlanych przestrzennie jako mapy sztywności (elastografy), gdzie kolor skaluje się z modułem ścinania. Elastogramy wykazują uderzające różnice w zakresie i rozkładzie modułu ścinania tkankowego w prawidłowym (ryc. 4A) i zwłóknieniowym (ryc. 4B) miąższu płuc oraz duże przestrzenne różnice w module ścinania, szczególnie w obrębie zwłóknienionej próbki płuca.

Rysunek 2. (A) Mikrografia z kontrastem fazowym przedstawiająca sondę AFM nad paskiem miąższu płuc myszy. Pasek skali, 50 μm. (B) Barwienie immunologiczne lamininy w normalnej tkance płucnej myszy pokazujące mikroarchitekturę pęcherzyków płucnych prawidłowego miąższu płuc. Białe pole wskazuje typowy obszar mapowania elastyczności 80 na 80 μm. Pasek skali: 20 μm. (C i D) Barwienie immunologiczne kolagenu I w miąższu płuc myszy leczonym solą fizjologiczną (C) i bleomycyną (D). Podziałka liniowa, 100 μm.

Rysunek 3. (A) Reprezentatywne, interpretowalne krzywe siły i przemieszczenia pobrane odpowiednio z miąższu płuc myszy leczonych solą fizjologiczną (niebieska) i bleomycyną (czerwona). Czarne linie są najlepiej dopasowane wynikającymi ze sferycznego modelu Hertza i są oznaczone odpowiadającymi im obliczonymi modułami Younga. (B, C) Reprezentatywne, nieinterpretowalne krzywe siła-przemieszczenie.

Rysunek 4. Reprezentatywne elastogramy pobrane z miąższu płuc myszy leczonych solą fizjologiczną (A) i bleomycyną (B). Kolorowe paski wskazują moduł ścinania w kilopaskalach. Etykiety osi wskazują skalę przestrzenną w mikrometrach. Podziałka: 20 μm

Discussion

Mechaniczna charakterystyka tkanki płucnej za pomocą mikrowgłębienia AFM oferuje niespotykaną rozdzielczość przestrzenną (ryc. 4), zapewniając unikalną perspektywę na mikroskalowe zmiany sztywności tkanki. Jako przykład jego użyteczności, wcześniejsze pomiary w skali makro w prawidłowych i zwłóknienionych paskach tkanki płucnej wykazały około 2-3-krotny wzrost elastancji przy zwłóknieniu^11,12. W przeciwieństwie do tego, mikrotwardnienie AFM ujawnia, że usztywnienie tkanek jest wysoce zlokalizowane, a niektóre regiony wykazują do ~30-krotnego wzrostu modułu ścinania powyżej mediany obserwowanej w normalnej tkance płucnej¹⁰. Ponieważ obecnie wiadomo, że sztywność matrycy ma krytyczny wpływ na funkcję komórki, te lokalne pomiary dostarczają nieocenionych parametrów zwiększających biowierność badania hodowli komórkowych komórek płuc.

W związku z użyciem cienkich pasków tkanki płucnej pojawia się kilka praktycznych problemów. Powierzchnie pasków nie są idealnie płaskie, ponieważ profil tkankowy podąża za architekturą leżących poniżej pęcherzyków płucnych. System AFM automatycznie dostosowuje położenie końcówki w kierunku Z podczas wgłębienia, gdy zmiana wysokości powierzchni próbki jest mniejsza niż 15 μm, aby pomóc w pokonaniu tego wyzwania. Pomiary są wykonywane w temperaturze pokojowej, a nie 37°C, więc odchylenia we właściwościach mechanicznych spowodowane tą zmianą temperatury nie mogą być oceniane, chociaż można się spodziewać, że będą one niewielkie. Wpływ leżącej poniżej architektury ścian wyrostka zębodołowego na obserwowane właściwości mechaniczne jest trudny do określenia przy użyciu obecnego zestawu mikroskopii świetlnej. Na przykład pożądane byłoby określenie, czy ściany wyrostka zębodołowego wykazują anizotropię i różne właściwości mechaniczne, gdy są wcięte w kierunkach wyrównanych z płaszczyzną ściany lub poprzecznych do niej. Jednak obecne próbki są grube, a system obrazowania nie ma możliwości 3D, stąd nie jest możliwe określenie lokalnej orientacji ścian wyrostka zębodołowego w każdym punkcie styku. Wreszcie, wpływ składników komórkowych na mierzone właściwości mechaniczne pozostaje w pełni wyjaśniony. W opisanych tutaj metodach nie podejmuje się żadnych wysiłków, aby specyficznie usunąć komórkowe składniki tkanki. Jednak jest mało prawdopodobne, aby komórki obecne na powierzchni dostępnej do wgłębienia były żywotne, biorąc pod uwagę czas, jaki upłynął od pobrania tkanki i konieczność przecięcia tkanki w celu uzyskania dostępu do pęcherzyków płucnych. Konkretne eksperymenty mające na celu usunięcie komórek lub ponowne zasiedlenie matryc żywotnymi komórkami i ocenę wynikających z tego zmian w sztywności tkanek wydają się uzasadnione.

Ponieważ do tych pomiarów potrzebna jest świeża, nieutrwalona tkanka, czas jaki upłynął od pobrania tkanki do pomiaru, powinien być zminimalizowany, a próbki powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zmian właściwości mechanicznych. Szczególną uwagę należy zwrócić za każdym razem, gdy paski tkanek są przenoszone między pojemnikami podczas mycia lub barwienia, tak aby zminimalizować zniekształcenia lub uszkodzenia. W przypadku aplikacji AFM w płynie kluczowym krokiem jest przecięcie tkanki tak płasko, jak to możliwe, i unieruchomienie próbki na podtrzymującym szkiełku nakrywkowym. Jeśli to możliwe, zautomatyzowana maszyna do cięcia, taka jak wibratoma lub krajalnica do tkanek, może być używana do krojenia plastrów o bardzo jednolitej grubości. Ważne jest, aby przymocować paski tkankowe bezpośrednio przed pomiarami AFM i zminimalizować czas, jaki upłynął na pomiary AFM, ponieważ próbka w końcu oderwie się od szkiełek nakrywkowych. Jedną z przydatnych obserwacji jest to, że większe paski wydają się bardziej stabilnie przylegać do szkiełek nakrywkowych i pozostają na miejscu przez dłuższy czas w PBS niż mniejsze paski.

Mikrotwardość AFM może charakteryzować próbki w szerokim zakresie od 100 Pa do 50 kPa (moduł ścinania) przy użyciu standardowego wspornika 0,06 N/m ze sferyczną końcówką o średnicy 5 μm. Zakres ten można rozszerzyć za pomocą sond o różnych stałych sprężystości; Sondy AFM z kulistymi szklanymi końcówkami o średnicy od 0,6 do 12 μm i stałymi sprężystości w zakresie od 0,01 do 0,58 N/m są dostępne na rynku i powszechnie stosowane³. W przypadku kulistej końcówki 5 μm teoretyczna powierzchnia styku między końcówką a tkanką wynosi około 5-9 μm² dla wgłębienia 400-700 nm (rys. 1A). Mniejsze lub większe końcówki mogą być używane do zapewnienia mniejszych lub większych skal rozdzielczości przestrzennej. Końcówki piramidalne zostały również wykorzystane w mikrowgłębieniach AFM^13-16, zapewniając mniejsze obszary kontaktu, a tym samym zwiększając rozdzielczość przestrzenną w mapowaniu, chociaż dopasowanie danych jest bardziej skomplikowane dla tej geometrii końcówki.

Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń tej metody. Płuca tradycyjnie charakteryzowano mechanicznie w sposób nieinwazyjny, na przykład za pomocą analizy ciśnienia i objętości¹⁷ lub wgłębień w całe płuca^19,20. Metody inwazyjne, takie jak ta opisana tutaj, zmieniają architekturę płuc w istotny sposób poprzez utratę granicy faz powietrze-ciecz, która normalnie występuje w płucach wypełnionych powietrzem, oraz utratę naprężenia wstępnego, które utrzymuje częściowe napompowanie płuc po rozluźnieniu mięśni oddechowych. Ograniczenia te są wspólne dla wszystkich pomiarów wykonanych w paskach tkanki płucnej¹⁸. Warto jednak zauważyć, że mediana sztywności mierzona w miąższu prawidłowej tkanki płucnej (moduł ścinania ~0,5 kPa) nie różni się istotnie od szacunków opartych na wgłębieniach w nienaruszone płuca przy objętościach spoczynkowych^19,20. Chociaż wiadomo, że tkanka płucna wykazuje nieliniowe usztywnienie wraz ze wzrostem deformacji, nie jest możliwe rygorystyczne sprawdzenie, czy ta właściwość utrzymuje się aż do mikroskali przy zastosowanych tutaj metodach. Model Hertza zakłada jednorodność próbki. Jednak większość materiałów biologicznych, w tym miąższ płuc, jest coraz bardziej niejednorodna w zmniejszających się skalach przestrzennych. Niejednorodność próbki może powodować artefakty, takie jak zmienność modułu Younga w zależności od głębokości wcięcia, tj. w zależności od warstwy lub komponentu, który ulega deformacji. Niejednorodność w płaszczyźnie xy można ograniczyć poprzez staranny dobór odpowiedniego rozmiaru kulistej końcówki w zależności od mikrostruktury biomateriału, zgodnie z propozycją Dimitriadisa EK i wsp.⁸ Znacznie trudniej jest przewidzieć lub skorygować błąd modelu Hertza ze względu na niejednorodność materiału w kierunku z. Azeloglu i in. zaproponowali niedawno hybrydowy model obliczeniowy do scharakteryzowania właściwości elastycznych heterogenicznego podłoża z dyskretnie osadzonymi inkluzjami²¹. Opracowana przez nich nowa technika stanowi potencjalny sposób obliczania właściwości inkluzyjnych materiałów niejednorodnych, pozwalając przezwyciężyć ograniczenia analizy Hertza.

Model Hertza zakłada również bezwzględne zachowanie sprężyste, podczas gdy materiały biologiczne zazwyczaj wykazują zachowania lepkosprężyste zależne od czasu. Pełną charakterystykę lepkosprężystą tkanki można uzyskać poprzez zmianę stosowanych prędkości wgłębień. Co ważne, wcześniejsze badania mechaniczne w skali makro prawidłowej i zwłóknieniowej tkanki płucnej wykazały słabą zależność częstotliwościową właściwości mechanicznych tkanki płucnej oraz zachowanie różnic między prawidłowymi i zwłóknienionymi właściwościami mechanicznymi tkanki we wszystkich badanych częstotliwościach¹¹. Odkrycia te zdecydowanie sugerują, że pomiar właściwości mechanicznych przy użyciu pojedynczej prędkości wgniecenia za pomocą AFM ujmuje istotny aspekt zmian we właściwościach mechanicznych tkanek, które towarzyszą zwłóknieniu.

Współczynnik Poissona wynoszący 0,4 dla tkanki płucnej użyty w tej pracy pochodzi z pomiaru makroskopowego⁹. Niestety, współczynnik Poissona w skali mikro i wszelkie zmiany w zależności od stanu choroby nie są dostępne w literaturze. Jako alternatywę dla E, E/(1-υ²) lub (1-υ²)/πE (oznaczane jako stała sprężystości k)²² można obliczyć na podstawie mikrowgłębienia AFM i podać, gdy współczynnik Poissona jest nieznany. W przypadku większości biomateriałów współczynnik Poissona mieści się w zakresie od 0,4 do 0,5 ze względu na ich wysoką zawartość wody. W zakresie 0,3-0,5 współczynnik 1/(1-υ²) waha się tylko od 1,10-1,33, tak że rozsądne zmiany współczynnika Poissona wywierają tylko niewielki wpływ na podany moduł. Wzrost modułu ścinania, który zgłaszamy dla tkanki zwłóknieniowej w stosunku do normalnej tkanki, jest kilkukrotnie większy, co oznacza, że błędy związane z zmianami współczynnika Poissona są niewielkie w stosunku do obserwowanych zmian właściwości mechanicznych.

Rzeczywisty algorytm i kod, które można wykorzystać do analizy danych dotyczących siły i przemieszczenia, podlegają specyficznym warunkom zastosowania i wynikającym z nich cechom różnych populacji krzywych siła-przemieszczenie. Jeśli bardziej wyrafinowana analiza jest interesująca, można zapoznać się z pracą Lina i ^wsp.23. Autorzy zestawili szereg synergicznych strategii w algorytm, który przezwycięża wiele komplikacji, które wcześniej utrudniały wysiłki na rzecz zautomatyzowania dopasowywania modeli Hertz do danych wcięć.

Dostępnych jest kilka innych obszarów do dalszego rozwoju i wykorzystania tej metody. W przypadkach, gdy ktoś jest zainteresowany wizualizacją ścian pęcherzyków płucnych bez znakowania przeciwciałami, zarówno elastynę, jak i kolagen można uwidocznić na podstawie ich sygnału autofluorescencyjnego w zielonym widmie. Z drugiej strony, lepsze obrazowanie, wykorzystujące cieńsze skrawki tkanki, techniki obrazowania 3D lub jedno i drugie, może zwiększyć zdolność do korelowania architektury tkanki z leżącymi u jej podstaw właściwościami mechanicznymi. Podczas gdy obecne metody umożliwiają barwienie i wizualizację składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen i laminina, dodatkowe wysiłki mogą być ukierunkowane na barwienie markerów powierzchni komórek w celu identyfikacji określonych populacji komórek i scharakteryzowania mikrośrodowisk mechanicznych w pobliżu takich populacji. Alternatywnie, tkanki można pobrać od myszy wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych markerów linii lub białek specyficznych dla komórki, aby osiągnąć ten sam cel. Wreszcie, opisana tutaj metoda wydaje się dobrze odpowiednia do scharakteryzowania innych cech anatomicznych w płucach, takich jak naczynia, które przebudowują się w nadciśnieniu i drogi oddechowe, które zmieniają się w astmie. Opierając się na obecnym stanie rozwoju i potencjale dalszej poprawy, mikrowgłębienie AFM wydaje się być gotowe do uzyskania cennych informacji na temat zmian sztywności tkanek, które towarzyszą postępowi choroby w płucach, i bez wątpienia będzie cenne w charakteryzowaniu przestrzennych i czasowych zmian sztywności wielu innych tkanek miękkich.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Końcówka AFM	Novascan Technologies, Inc.	PT.GS	Koralik borokrzemianowy 5 mikronów, 0,06 N/m
Szkiełka nakrywkowe z poli-L-lizyny	VWR international	354085	BD BioCoat 12 mm okrągłe szkło nr 1
agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma-Aldrich	A0701
Królicze przeciwciało anty-kolagenowe I (Rb pAb)	Abcam	ab34710-100
Alexa Fluor 546 kozie przeciwciało anty-królicze	Invitrogen	A11010
Królik anty-Laminin	Sigma-Aldrich	L9393