Niniejsze badanie opisuje metodę pozwalającą na szybką i jednoznaczną diagnostykę chorób wirusowych roślin w czasie około pół dnia, wykorzystując połączenie wspomaganego mikrofalowo przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz metod barwienia negatywowego.
Artykuł metodologiczny
Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania zmian ultrastrukturalnych indukowanych przez wirusy są często niezbędne do jednoznacznego zidentyfikowania chorób wirusowych roślin. Przy zastosowaniu konwencjonalnego przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) takie badania mogą trwać kilka dni1,2, przez co nie nadają się do szybkiej diagnostyki chorób wirusowych roślin. Fixacja mikrofalowa może być wykorzystana do drastycznego skrócenia czasu przygotowania próbek do badań TEM, dając podobne wyniki ultrastrukturalne, jakie obserwuje się po konwencjonalnym przygotowaniu próbek3-5. Obecnie dostępnych jest wiele różnych, wykonanych na zamówienie urządzeń mikrofalowych, które mogą być stosowane do skutecznej fixacji i zatapiania próbek biologicznych do badań TEM5-8. W niniejszym badaniu wykazujemy na przykładzie roślin Nicotiana tabacum zainfekowanych wirusem mozaiki tytoniu (TMV), że możliwe jest zdiagnozowanie zmian ultrastrukturalnych w liściach w ciągu około pół dnia, stosując przygotowanie próbek wspomagane mikrofalowo do TEM. Zdecydowaliśmy się przeprowadzić to badanie z użyciem dostępnego komercyjnie urządzenia mikrofalowego, ponieważ przygotowuje ono próbki niemal całkowicie automatycznie5, w przeciwieństwie do innych dostępnych urządzeń, w których wiele etapów wciąż musi być wykonywanych ręcznie6-8, co czyni je bardziej czasochłonnymi i pracochłonnymi. Ponieważ przygotowanie próbek odbywa się w pełni automatycznie, podczas fixacji i zatapiania można przeprowadzić barwienie negatywne cząstek wirusowych w soku z pozostałych zainfekowanych TMV liści, a następnie zbadać ich ultrastrukturę i rozmiar.
Protokół
Przygotowanie próbek z wykorzystaniem mikrofal
- Przed rozpoczęciem przygotowania próbek należy zaprogramować automatyczny mikrofalowy procesor tkanek do mikroskopii elektronowej (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Wiedeń, Austria) zgodnie z poniższymi protokołami (Tabela 1) dla mikrofalowego przygotowania próbek do TEM:
Tabela 1. Protokół przygotowania próbek z wykorzystaniem napromieniowania mikrofalowego. Poszczególne kolumny przedstawiają (od lewej do prawej):
- Numer probówki (Vial nr.), określający kolejność ładowania probówki do karuzeli procesora.
- Krok właściwego procesu.
- Odczynniki w probówkach.
- Czas trwania danego kroku.
- Maksymalna temperatura osiągana w probówce przed wyłączeniem napromieniowania mikrofalowego.
- Ustawienie napromieniowania mikrofalowego: Continuous (ciągłe) = szybki wzrost temperatury, utrzymanie zadanej temperatury; Slope (liniowe) = łagodny wzrost temperatury, temperatura końcowa osiągana na końcu; Pulsed (pulsacyjne) = szybki wzrost temperatury, wyłączenie mocy do spadku temperatury o 5°C, następnie ponowne włączenie mocy w celu osiągnięcia temperatury.
- Maksymalna moc napromieniowania mikrofalowego.
- Należy na świeżo przygotować roztwory do poszczególnych kroków opisanych w protokole przygotowania próbek (w przypadku żywicy epoksydowej Agar 100 patrz pkt 1.7), przelać je do odpowiednich probówek zgodnie z zaprogramowanym protokołem (Tabela 1), załadować probówki do karuzeli, a następnie włożyć karuzelę do mikrofalowego procesora tkanek i na koniec wprowadzić pierwszą probówkę do komory jednomodułowej.
- Wykrawać małe fragmenty liści (1mm2) z Nicotiana tabacum zainfekowanej wirusem mozaiki tytoniu (TMV), używając ostrza żyletki na płytce z wosku modelarskiego, w kropli 3% glutaraldehydu (Agar Scientific Ltd., Stansted, Anglia) w 60mM buforze fosforanowym Sørensen (pH 7.2) w temperaturze pokojowej.
- Przenieść fragmenty pęsetą bezpośrednio do odpowiednich koszyczków o szerokości oczek ok. 200μm. Ułożyć koszyczki jeden na drugim i włożyć je do komory jednomodułowej. Należy zadbać o to, aby podczas ładowania i układania koszyczków próbki były stale pokryte roztworem fiksacyjnym, aby nie wyschły.
- Uruchomić wcześniej zaprogramowany mikrofalowy protokół przygotowania próbek dla fiksacji, odwodnienia i infiltracji.
- Podczas automatycznego przygotowania próbek przez mikrofalowy procesor tkanek, kontynuować barwienie negatywne pozostałego materiału roślinnego zgodnie z opisem w sekcji 3 (barwienie negatywne).
- Na świeżo przygotować żywicę epoksydową Agar 100, mieszając poniższe składniki w opisany sposób: do plastikowego kubka wlać 24g Agar 100, 16g bezwodnika dodecenylosumczynianowego oraz 10 g bezwodnika nadycznego (wszystkie składniki: Agar Scientific Ltd., Stansted, Anglia), podgrzać do 40°C i dobrze wymieszać. Dodać 1,2g benzylodimetyloaminy i dokładnie wymieszać. Wlać żywicę epoksydową Agar 100 do odpowiednich form polimeryzacyjnych tuż przed zakończeniem protokołu przygotowania próbek (np. podczas kroku 22 w tabeli 1).
- Po zakończeniu protokołu (po kroku 22 w tabeli 1) przenieść ułożone koszyczki zawierające infiltrowane próbki z komory jednomodułowej do ostatniej probówki w karuzeli. Wyjąć karuzelę z urządzenia mikrofalowego, rozdzielić koszyczki i za pomocą pęsety przenieść próbki do odpowiednich form polimeryzacyjnych. Należy zadbać o to, aby podczas rozdzielania i ładowania próbki były zawsze pokryte żywicą epoksydową Agar 100, aby nie wyschły.
- Ułożyć formy polimeryzacyjne jedną na drugiej. Należy zadbać o to, aby podczas układania i ładowania próbki były zawsze pokryte żywicą epoksydową Agar 100, aby nie wyschły.
- Wyjąć wcześniej użyte probówki z karuzeli mikrofalowego procesora tkanek, załadować ją ułożonymi koszyczkami i włożyć karuzelę z powrotem do procesora.
- Uruchomić wcześniej zaprogramowany protokół polimeryzacji (tabela 1).
- Podczas automatycznego przeprowadzania polimeryzacji przez mikrofalowy procesor tkanek, badać siatki z barwieniem negatywnym za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego [np. Philips CM10 TEM, FEI (dawniej Philips), Eindhoven, Holandia] i przeprowadzić analizę obrazu zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4 (barwienie negatywne i analiza obrazu).
- Po zakończeniu protokołu wyjąć formy polimeryzacyjne z komory jednomodułowej, rozdzielić je i wyjąć spolimeryzowane bloczki zawierające próbki. Są one teraz gotowe do cięcia mikrotomem.
2. Przycinanie i krojenie
- Wstaw jeden lub więcej bloków do osobnych uchwytów na próbki do sekcjonowania ultratonkiego, tak aby próbka znajdowała się na górze i wystawała z uchwytu na około 1cm.
- Przytnij blok przy użyciu przyrządu do przycinania próbek do TEM (np. Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), aby uzyskać powierzchnię bloku o maksymalnej długości 1mm i szerokości 200μm, zawierającą jak największą ilość materiału liścia (rozmiar powierzchni bloku może wymagać dostosowania do rozmiaru noża diamentowego).
- Wykonaj sekcje bloku za pomocą ultramikrotomu (np. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems), używając noża diamentowego pod kątem 45° (np. Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Austria). Grubość sekcji należy ustawić na około 70 do 90nm, a prędkość cięcia na około 1mm/s. Zbierz kilka sekcji na miedzianą lub niklową siateczkę o oczkach 200, powleczoną formvarem (Agar Scientific Ltd.).
- Przeprowadź barwienie kontrastowe sekcji na siateczce cytrynianem ołowiu (Agar Scientific Ltd.; 1,1g cytrynianu ołowiu rozpuszczonego w 42ml wody dwukrotnie destylowanej i 8ml 1N NaOH) przez 5 minut w szalce Petri częściowo wypełnionej NaOH, aby stworzyć środowisko wolne od CO2, a następnie przez 15 minut 1% octanem uranylu (Agar Scientific Ltd.) rozpuszczonym w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej. Pomiędzy każdym etapem barwienia kontrastowego przemywaj siateczki wodą destylowaną przez 1 minutę. Osusz siateczki na powietrzu w kasecie do siateczek.
- Obejrzyj sekcje w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (np. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, The Netherlands).
3. Barwienie negatywne
- Zebrać około 100mg materiału liściowego zainfekowanego TMV i przygotować surowy sok poprzez homogenizację materiału przez 2 minuty za pomocą żyletki na szkiełku przedmiotowym w 100μl 60mM buforu fosforanowego Sörensensa (pH 7,2).
- Przenieść 20μl otrzymanego homogenatu do pierwszej studni teflonowej płytki mikroskopowej z 4 lub więcej studniami (alternatywnie można przenieść homogenat na kawałek parafilmu).
- Umieścić siatkę pokrytą formvarem na wierzchu homogenatu stroną pokrytą formvarem (Agar Scientific Ltd.) skierowaną w stronę kropli i inkubować przez 5 minut.
- Przemyć siatkę 2 razy po 2 minuty, kładąc ją na dwóch kroplach po 200μl 60mM buforu fosforanowego Sörensensa (pH 7,2).
- Inkubować siatkę przez 1 minutę w świeżo przygotowanym 2% roztworze kwasu fosfotungstowego (Agar Scientific Ltd.) w 60mM buforze fosforanowym Sörensensa (pH 6,5).
- Wyjąć siatkę i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w kasetce na siatki.
- Obejrzeć siatkę w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (np. Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Holandia). Wykonać co najmniej 10 obrazów losowo wybranych, negatywnie barwionych wirionów (na każdym obrazie powinno być widocznych co najmniej 10 lub więcej wirionów) przy powiększeniu pierwotnym 21000X lub wyższym. Należy zadbać o to, aby wszystkie obrazy miały takie samo powiększenie.
4. Analiza obrazów
- Pomiar długości i szerokości co najmniej 100 losowo wybranych pojedynczych cząsteczek wirusa na mikrografiach wykonanych z próbek barwionych negatywnie, przy użyciu dowolnego oprogramowania do analizy obrazu [np. Cell D (Olympus, Life and Material Science Europe GmbH, Hamburg, Germany) z narzędziem do analizy cząsteczek lub Optimas 6.5.1- (Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)].
- Obliczenie średnich i odchyleń standardowych w celu wyznaczenia średniej długości i szerokości cząsteczek wirusa zwizualizowanych metodami barwienia negatywnego oraz TEM.
- Porównanie długości i cech ultrastrukturalnych (uzyskanych w pkt 2.5) z rozmiarami wirusów oraz zmianami ultrastrukturalnymi wywołanymi przez choroby wirusowe znane z literatury w celu jednoznacznej identyfikacji chorób wirusowych.
5. Reprezentatywne wyniki:
Po przygotowaniu próbek z wykorzystaniem mikrofal można było zaobserwować w mikroskopie elektronowym transmisyjnym typowe zmiany ultrastrukturalne wywołane przez TMV, takie jak rozległe obszary zawierające wiriony ułożone równolegle w cytozolu zainfekowanych komórek Nicotiana tabacum (Rys. 1A). Dodatkowo w surowym soku z liści zainfekowanych TMV, po barwieniu negatywowym, cząsteczki TMV były widoczne jako giętkie struktury w kształcie pręta (Rys. 1B). Analiza obrazu 100 cząsteczek wirusa wykazała, że średni rozmiar TMV wynosi 280 nm długości i 17 nm szerokości (Rys. 2). Stwierdzono, że ultrastruktura w komórkach zainfekowanych TMV oraz rozmiar wirionów zaobserwowane w niniejszej badaniu są zgodne z właściwościami ultrastrukturalnymi wywołanymi przez TMV w tytoniu oraz z zakresem wielkości cząsteczek TMV raportowanym wcześniej w literaturze9-15.
Rycina 1. Mikrografie transmisyjne elektronowe komórek liścia zainfekowanych TMV oraz wirionów. A) Obraz przedstawia ultrastrukturę komórek mezofilu liścia Nicotiana tabacum zainfekowanych TMV po przygotowaniu próbki roślinnej z wspomaganiem mikrofalowym. Zwróć uwagę na duży obszar równolegle ułożonych wirionów nagromadzonych w cytosolu. C=chloroplast ze skrobią (St), M=mitochondrium, N=jądro komórkowe, V=wakuola, Bar=2μm. B) Obraz przedstawia wiriony wykryte metodą barwienia negatywnego w soku z zainfekowanych liści.
Rysunek 2. Względna wielkość wirionów. Względny rozkład długości i szerokości cząsteczek TMV po barwieniu negatywowym soku z zainfekowanych liści, widziany w mikroskopie elektronowym. Wartości średnie (średnia długość/szerokość ± odchylenie standardowe) obliczono na podstawie 100 wirionów.
Dyskusja
Wykazano, że przygotowanie próbek roślinnych do TEM z wspomaganiem mikrofalowym dostarcza szybkich i wiarygodnych danych ultrastrukturalnych w ciągu zaledwie kilku godzin3,4,16. Zachowanie struktur subtelnych organelli i błon osiągnięte za pomocą metody zastosowanej w niniejszej pracy było zbliżone do próbek utrwalanych konwencjonalnie oraz kriofiksacją5,15, z tą przewagą, że czas utrwalania i zatapiania próbek został drastycznie skrócony z 3 dni lub więcej do około 2 godzin. Stanowi to najszybszy dostępny obecnie w literaturze protokół przygotowania próbek do TEM. Metoda opisana w tej pracy łączyła przygotowanie próbek roślinnych do TEM z wspomaganiem mikrofalowym z metodami barwienia negatywnego, co pozwoliło na jasną i szybką identyfikację zmian ultrastrukturalnych wywołanych przez TMV oraz samego czynnika wirusowego. Zmiany ultrastrukturalne wywołane przez TMV mogły zostać zbadane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym po przycięciu, sekcjonowaniu i dobarwieniu w ciągu około 4 godzin od rozpoczęcia utrwalania. Wykorzystanie w pełni automatycznego trybu przygotowania preparatów pozwoliło badaczowi na przeprowadzenie w międzyczasie barwienia negatywnego w celu określenia wielkości i szerokości czynnika wirusowego. Można zatem wywnioskować, że metoda ta umożliwia jasną i szybką diagnostykę chorób wirusowych roślin w ciągu około pół dnia, co ma duże znaczenie dla przyszłego zastosowania w rolnictwie i eksperymentach naukowych w dziedzinie fitopatologii roślin. Ponieważ metoda ta mogłaby być również stosowana do szybkiej diagnostyki chorób zwierząt i ludzi, posiada ona duży potencjał do przyszłych zastosowań w patologii medycznej i weterynaryjnej.
Oświadczenia
Brak declared konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF, granty P20619 i P22988 dla B.Z.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Glutarsaldehyd | Agar Scientific | R1312 | |
| Tetrotransfected osmu | Agar Scientific | R1022 | |
| Żywica Agar 100 | Agar Scientific | R1043 | |
| Bezwodnik bursztynowy dodecenylowy | Agar Scientific | R1051 | |
| Bezwodnik nadynowy metylowy | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzylodimetyloamina | Agar Scientific | R1060 | |
| Cytrynian ołowiu | Agar Scientific | R1210 | |
| Octan uranylu | Agar Scientific | R1260A | |
| Kwas fosfotungstowy | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Dostępny nowszy model | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Dostępny nowszy model | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Dostępny nowszy model | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Dostępna nowsza wersja |
Bibliografia
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
Przedruki i uprawnienia
