Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Podsumowanie

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Streszczenie

Drosophila od dawna służy jako system modelowy do badania rozwoju, głównie ze względu na łatwość manipulacji genetycznych. Na przestrzeni lat opracowano mnóstwo szczepów mutantów i rozwiązań technicznych, które pozwalają na formułowanie i udzielanie odpowiedzi na złożone pytania w rozsądnym czasie. Podstawowa wiedza na temat oddziaływania komponentów wszystkich znanych głównych szlaków sygnalizacyjnych została uzyskana w badaniach genetyki w przód oraz genetyki odwrotnej u Drosophila. Oko muchy okazało się wyjątkowo odpowiednie do analizy mutacyjnej, ponieważ w warunkach laboratoryjnych muchy mogą przeżyć bez funkcjonalnych oczu. Co więcej, powierzchnia oka owada składa się z około 800 pojedynczych oczu jednostkowych (facetek lub ommatidiów), które pod mikroskopem stereoskopowym tworzą regularną, gładką powierzchnię. Dzięki temu łatwo jest stwierdzić, czy mutacja wpływa na rozwój lub wzrost oka, obserwując zewnętrznie utratę gładkiej powierzchni (fenotyp „szorstkiego oka”; Ryc. 1) lub odpowiednio ogólny rozmiar oka (przykłady przesiewów opartych na zewnętrznej morfologii oka patrz np.¹). Dalsze szczegółowe analizy fenotypów oka wymagają fiksacji, zatopienia w plastiku i wykonywania cienkich skrawków oczu dorosłych osobników.

Oko Drosophila rozwija się z tak zwanego tarczy imaginalnej oka, czyli zbioru komórek nabłonkowych, które proliferują i różnicują się podczas stadiów larwalnego i poczwarki (przegląd patrz np. ²). Każdy ommatidium składa się z 20 komórek, w tym ośmiu fotoreceptorów (PR lub komórki R; Ryc. 2), czterech wydzielających soczewkę komórek stożkowych, komórek pigmentowych („heksagon” wokół skupiska komórek R) oraz szczecinki. Fotoreceptory każdego ommatidium, najłatwiej identyfikowalne po ich światłoczułych organellach – rhabdomerach – są zorganizowane w trapez składający się z sześciu fotoreceptorów „zewnętrznych” (R1-6) i dwóch „wewnętrznych” (R7/8; R8 [Ryc. 2] znajduje się pod R7 i jest zatem widoczny tylko w przekrojach z głębszych obszarów oka). Trapez każdej facetki jest precyzyjnie wyrównany z trapezami sąsiednich facetek oraz z ogólnymi osiami przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną oka (Ryc. 3A). W szczególności ommatidia grzbietowej i brzusznej (odpowiednio czarne i czerwone strzałki) połowy oka są swoimi odbiciami lustrzanymi i odpowiadają dwóm formom chiralnym ustalonym podczas sygnalizacji planarnej polaryzacji komórkowej (przegląd patrz np. ³).

Opisana tutaj metoda przygotowania półcienkich przekrojów oka (takich jak te przedstawione na rys. 3) jest lekko zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Tomlinsona i Ready'ego⁴. Pozwala ona na analizę morfologiczną wszystkich komórek z wyjątkiem przezroczystych komórek stożkowych. Dodatkowo pigment komórek R (niebieskie groty strzałek na rys. 2 i 3) może służyć jako marker autonomiczny komórkowo dla genotypu komórki R, dzięki czemu można łatwo określić wymagania genetyczne genów w podzbiorze komórek R^5,6.

Protokół

1. Disekcja głowy muchy

1. Upewnij się, że wszystkie materiały są pod ręką (w tym szkiełka pokryte żelatyną). Przygotuj utrwalacze z glutaraldehydem i osmem (patrz poniżej). Dla każdego genotypu przeznaczonego do zatopienia, odmierz 200μl roztworu utrwalającego z glutaraldehydem do probówek 1,5 ml i umieść je w lodzie.
2. Znieczul muchy na podkładce z CO₂ (zazwyczaj preparujemy siedem głów much, aby zatopić sześć na genotyp, na wypadek gdyby jedna głowa została zniszczona podczas procedury).
3. Przytrzymaj i lekko dociśnij tułów muchy, stroną grzbietową do góry, pęsetą i za pomocą ostrego skalpela odetnij głowę.
4. Ustabilizuj głowę muchy, dotykając karku pęsetą, i ostrożnie odetnij niewielką część jednego oka. Ułatwia to penetrację utrwalacza (jeśli planujesz wykorzystać przekroje oka do analizy klonalnej, odetnij część oka bez klonów lub z mniejszymi klonami). Unikaj dotykania i uszkadzania nienaruszonego oka, które zostanie później poddane sekcjonowaniu.
5. Dotknij głowy pęsetą lub skalpelem w miejscu odciętego oka i przenieś głowę do utrwalacza glutaraldehyd/fosforan w lodzie (głowy często pływają na powierzchni utrwalacza). Wypreparowane głowy nie powinny pozostawać w utrwalaczu z glutaraldehydem dłużej niż 15 minut przed dodaniem osmu. Powtórz kroki 1.2- 1.5 dla pozostałych much tego samego genotypu.

2. Fixacja i zatapianie (na wszystkich etapach należy używać rękawiczek!)

1. Wirować głowy much w wirówce Eppendorf przez 1 minutę przy 10 000 rpm. Kontynuować procedurę nawet jeśli głowy nie opadną na dno.
2. Dodać 200μl roztworu OsO₄ i utrwalać przez co najmniej 30 minut, maksymalnie do 1 godziny w lodzie.
3. Za pomocą pipety Pasteura usunąć roztwór glutaraldehydu/osmu (należy przestrzegać odpowiednich procedur utylizacji odpadów!) i zastąpić go 200μl roztworu osmu. Inkubować w lodzie przez 1-6 h. Należy zawsze upewnić się, że głowy są całkowicie przykryte cieczą; nigdy nie należy usuwać całego roztworu, ponieważ głowy lub oczy mogą ulec zapadnięciu!
4. Za pomocą pipety Pasteura usunąć utrwalacz, dodać 0,5-1ml 30% etanolu i inkubować przez co najmniej 5 minut w lodzie (należy przestrzegać odpowiednich procedur utylizacji odpadów, ponieważ etanol zawiera teraz osm!).
5. Powtórzyć powyższy krok, stosując kolejno etanol 50%, 70%, (80%), 90% oraz dwukrotnie 100%. Uwzględnić krok z 80% etanolem, jeśli oczy będą przeznaczone do analizy mikroskopowej w mikroskopie elektronowym. Po etapie płukania w 70% etanolu próbki można wyjąć z lodu.
6. Zastąpić etanol równą objętością tlenku propylenu (substancja lotna, kontynuować pracę pod wyciągiem). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Powtórzyć płukanie tlenkiem propylenu. W przypadku przetwarzania wielu genotypów równolegle, pracować w partiach, aby uniknąć zapadnięcia się oczu na skutek odparowania tlenku propylenu.
8. Usunąć większość tlenku propylenu i za pomocą plastikowej pipety transferowej dodać około 500μl roztworu żywicy i tlenku propylenu w stosunku 1:1. Pozostawić do wyrównania na noc w temperaturze pokojowej.

3. Zatapianie i rozmieszczanie w formach

1. Upewnij się, że wszystkie formy są oznakowane, aby móc śledzić poszczególne genotypy, a następnie wypełnij formy w 100% żywicą. Nie przepełniaj ich (powierzchnia form nie powinna tworzyć „kopców” przy patrzeniu poziomo wzdłuż formy). Do analizy EM stosuj żywicę twardą.
2. Za pomocą pipety transferowej usuń 50% żywicę z głów, zastąp ją żywicą 100% i inkubuj przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej. W miarę infiltrowania głów żywicą, będą one opadać na dno probówki.
3. Używając wykałaczki, którą uderzono raz o twardą powierzchnię, aby stworzyć mały haczyk, przenoś po jednej głowie do formy.
4. Umieść folię aluminiową na obszarze roboczym stereomikroskopu, aby chronić go przed rozlaniem żywicy.
5. Używając igły sekcyjnej i patrząc przez mikroskop, lekko zakręć głową w żywicy i ostrożnie przesuń ją na dno formy, blisko jej zaostrzonego końca.
6. Ostrożnie ustaw powierzchnię nienaruszonego (!) oka (lub przyszłą płaszczyznę cięcia, jeśli chcesz uzyskać przekroje poprzeczne) szyją w dół, równolegle do przedniej ścianki formy, dbając o to, aby styczna powierzchnia oka znajdowała się w odległości około połowy średnicy głowy od ścianki formy. W rzadkich przypadkach oko może ulec zapadnięciu, co objawia się pustą przestrzenią między powierzchnią oka a kutykulą głowy. Jeśli oko jest zapadnięte, zastąp je 7^tym zapasowym okiem.
7. Powtórz czynność dla wszystkich głów. Po zakończeniu ustawiania wszystkich próbek, ponownie sprawdź wszystkie oczy, aby upewnić się, że nie przesunęły się podczas wyjmowania igły z żywicy.
8. Jeśli masz problem z przemieszczaniem się oczu podczas wyjmowania igły sekcyjnej, ustaw oko w pożądanej pozycji, szybko cofnij igłę nieco od głowy, a następnie powoli wyjmij ją całkowicie.
9. Utwardzaj formy w piecu przez noc w temperaturze 70°C.

4. Przycinanie i krojenie

1. Wyjąć utwardzone bloki z form poprzez ich wygięcie, monitorując, który blok odpowiada któremu genotypowi (np. przechowując je w małych fiolkach scyntylacyjnych).
2. Do przycinania należy użyć uchwytu odpowiedniego dla posiadanego mikrotomu, zamontowanego stroną górną do góry na bloku z pleksiglasu lub aluminium. Zamontować w uchwycie blok do przycięcia, stroną oka do góry.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając żyletek z powłoką teflonową, ostrożnie odciąć tylko górną warstwę bloku. Pozostawi to przejrzystą powierzchnię, przez którą powinno być widoczne oko, co pozwoli przewidzieć przyszłą płaszczyznę cięcia. Należy uważać, aby nie skaleczyć palców!
4. Odciąć nadmiar plastiku po obu stronach głowy oraz z przodu (tj. z miejsca, które było górą formy podczas ustawiania oczu), aż większość plastiku wokół głowy zostanie usunięta. Najlepiej jest powoli zbliżać się do głowy, odcinając wiele cienkich warstw plastiku.
5. Używając czystej żyletki, ostrożnie usuwać cienkie warstwy z górnej części oka dokładnie w płaszczyźnie, w której planowane jest późniejsze cięcie (zazwyczaj stycznie do oka, pod niewielkim kątem w stosunku do pierwotnej powierzchni formy).
6. Kontynuować proces do momentu, gdy zacznie być odcinana zewnętrzna powierzchnia oka. Należy upewnić się, że używa się czystych fragmentów ostrza, aby uzyskać błyszczącą, przezroczystą powierzchnię, co ułatwia ustawienie w mikrotomie.
7. Aby oszczędzać żyletki, należy używać starszych ostrzy do wstępnego przycinania boków bloku i świeżej żyletki do precyzyjnego przycinania (krok 3 i 5). W rezultacie powstanie trójboczna piramida z lekko pochyloną, ściętą górą, która odpowiada przyszłej płaszczyźnie cięcia.
8. Zamontować blok w mikrotomie. Sam proces krojenia będzie się różnić w zależności od typu mikrotomu i nie zostanie tutaj opisany szczegółowo. My używamy Sorvall MT5000 z diamentowym nożem klasy histologicznej do uzyskania przekrojów o grubości od 0,5 do 1μm. W przypadku analizy pod mikroskopem świetlnym niewielkie różnice w grubości przekrojów nie mają znaczenia. Przy krojeniu klonów znakowanych transgenem White+, należy wykonywać przekroje o grubości 1μm, aby zapewnić wystarczającą liczbę ziarn pigmentu przylegających do rabdomerów na każdy przekrój (Ryc. 2).
9. Przekroje będą pływać na wodzie. Pierwsze 20-30 przekrojów należy podnieść spłaszczonym końcem drewnianego patyczka kosmetycznego z poziomu pod powierzchnią wody ruchem obrotowym i przenieść do kropli wody na szkiełku przedmiotowym pokrytym żelatyną (utrzymywanym na płycie grzewczej w temperaturze około 100°C).
10. Powtórzyć czynność z kolejnymi 20-30 przekrojami. Odczekać, aż woda wyparuje, a przekroje przywrą do szkiełka. Zazwyczaj na jednym szkiełku dobrze mieszczą się przekroje z 3 oczu ułożone w trzech kolumnach (trzy oczy) i dwóch rzędach (przekroje górne/dolne).

5. Barwienie i analiza mikroskopowa

1. Jeśli nie wykonuje się klonowania sekcji, należy barwić preparaty. Slajd z sekcjami należy umieścić na bloku grzejnym ustawionym na 90°C. Za pomocą strzykawki 30 ml z dołączonym filtrem 0,22μm nanieść na slajd roztwór barwiący błękitem toluidynowym i barwić przez 10 sekund. Natychmiast obficie wypłukać wodą destylowaną. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej nanieść 3 krople medium montażowego DPX na slajd i przykryć szkiełkiem podstawowym. Położyć na wierzchu 3 monety i pozostawić medium montażowe do stwardnienia (np. przez noc w temperaturze pokojowej).
3. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu świetlnego. Użyj obiektywu 5x lub 10x, aby znaleźć odpowiednią sekcję, a następnie przełącz na obiektyw imersyjny 63x w celu szczegółowej analizy i fotografowania. Zazwyczaj stosujemy ustawienia kontrastu fazowego, ale optyka ciemnego pola również się sprawdza.

6. Reprezentatywne wyniki:

Najczęściej oczy są zatapiane w plastiku w celu szczegółowej analizy zewnętrznych fenotypów szorstkiego oka wykrytych w ramach screeningu genetycznego lub w procesie testowania interakcji genetycznych z genami znanymi z wpływu na ogólną strukturę oka lub jego polarność. Typowe wyniki przekrojów oka przedstawiono na rysunku 3. Ommatidia typu dzikiego (rys. 3A) wykazują pełny zestaw fotoreceptorów otoczony siecią komórek pigmentowych. W przeciwieństwie do nich, u mutanta strabismus (stbm, znanego również jako van-gogh⁷) polarność ommatidialna jest utracona i, mimo obecności pełnego zestawu fotoreceptorów, rotacja i chiralność są zrandomizowane (rys. 3B). Ponadto, ponieważ analizowany przekrój allelu stbm był w tle w^-, na rys. 3B brakuje ziarn pigmentu. Rysunek 3C przedstawia przykład analizy klonalnej. Kinaza Rho Drosophila (drok) jest niezbędna do rotacji ommatidialnej, a także do integralności strukturalnej oka⁸. Klony homozygotyczne drok² można zidentyfikować po braku pigmentu w komórkach pigmentowych i rhabdomerach (zazwyczaj klony są indukowane przy użyciu eyeless-FLP oraz P-elementu z silnie eksprymowanym markerowym genem white, uzupełniającym mutację tła w^- w tkance typu dzikiego i heterozygotycznej). Możliwa jest zatem identyfikacja obszarów mutantowych na podstawie braku pigmentu. Ze względu na wspomnianą wcześniej autonomię komórkową pigmentacji w komórkach R, można określić genotypy poszczególnych komórek R (patrz groty strzałek na rys. 3C).

Rycina 1. Oko Drosophila stanowi doskonały system modelowy dla biologów, ponieważ w przeciwieństwie do gładkiej powierzchni oka typu dzikiego (A), powierzchnia oka mutantów jest często zewnętrznie chropowata (B), co wskazuje na leżące u podstaw fenotypy oka. Na wszystkich rysunkach strona przednia znajduje się po lewej, a grzbietowa u góry. Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA.

Rysunek 2. Obrazy z mikroskopii świetlnej pojedynczych ommatidiów przekrojonych zgodnie z opisaną metodą. W każdym ommatidium jednocześnie widocznych jest tylko siedem komórek R, ponieważ R7 znajduje się nad R8. (A, A') Na poziomie R7 ciało komórki R7 jest widoczne pomiędzy R1 a R6 (żółta strzałka w A'). W przeciwieństwie do tego, na poziomie R8 (B), ciało komórki R8 jest widoczne pomiędzy R1 a R2 (żółta strzałka w B'). Niebieskie groty strzałek wskazują ziarna pigmentu, które mogą służyć jako komórkowy marker pigmentu.

Rycina 3. Przekroje styczne przez dorosłe oczy Drosophila typu dzikiego (A), mutantów stbm (B) oraz drok (C). Schematy poniżej przekrojów wskazują polarność ommatidiów (patrz strzałki na (A)). Okręgi reprezentują ommatidia z defektami w obrębie komplementu fotoreceptorów. Żółte linie reprezentują grzbietową/brzuszną linię symetrii (równik). W przeciwieństwie do prawidłowo zorientowanych ommatidiów typu dzikiego (A), organizacja planarna jest utracona u mutanta stbm (B). Należy zauważyć, że pokazany przekrój mutanta stbm nie posiada pigmentu ze względu na tło mutacyjne w genie w^-. (C) Ponieważ mutacje drok są letalne, muszą być one analizowane w klonach. W związku z tym komórki pigmentowane są typu dzikiego lub heterozygotyczne (wypełnione niebieskie groty strzałek), natomiast komórki R pozbawione pigmentu (otwarte niebieskie groty strzałek) są mutantami homozygotycznymi. Oprócz defektów rotacji, mutanty drok wykazują również defekty strukturalne, w tym brak lub nadmiar komórek R. Należy zauważyć, że w celu analizy klonalnej przekroje nie zostały zabarwione, aby uniknąć przysłonięcia granulek pigmentu.

Dyskusja

Wykorzystanie Drosophila jako organizmu modelowego w badaniach genetycznych doprowadziło do identyfikacji wielu kluczowych członków rodzin genów niezbędnych dla większości wysokokonserwowanych szlaków sygnalizacyjnych u eukariotów wyższych, w tym u ludzi. Ponieważ w warunkach laboratoryjnych funkcjonalne oko nie jest niezbędne do przeżycia, jest ono tkanką szczególnie odpowiednią do odkrywania nowych funkcji genów i oceny sieci genetycznych. Analiza ultrastrukturalna oka muchy z zastosowaniem opisanej metody doprowadziła zatem do fundamentalnych odkryć istotnych dla rozwoju i chorób. Początkowo analiza klonalna pojedynczych komórek była przeprowadzana z wykorzystaniem klonów indukowanych promieniami rentgenowskimi w połączeniu ze znanymi, ściśle powiązanymi komórkowymi markerami recesywnymi. W ostatnim czasie dostępność systemu FLP/FRT do generowania klonów znacznie ułatwiła analizę fenotypową mutacji letalnych w przekrojach oka^6,9.

Analiza przekrojów oka nie ogranicza się do opisanych tutaj przekrojów stycznych. W razie potrzeby głowy można ustawić w formach w dowolnej orientacji, aby uzyskać przekroje poprzeczne do badania głębszych warstw głowy, takich jak lamina i medulla. Opisany tutaj protokół jest zatem wszechstronną metodą analizy struktur oka i głowy u dorosłych osobników Drosophila.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogólne wyposażenie: Ogólne zasady hodowli muszek opisano w 10 Standardowy mikroskop stereoskopowy (np. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), najlepiej z pierścieniowym źródłem światła, aby zapobiec rzucaniu cienia przez dłonie. CO2 Podkładka do much, pokryta papierem Whatmana 3MM w celu zapewnienia ochrony przed zanieczyszczeniami podczas sekcji. Szkiełka pokryte żelatyną: rozpuścić 10 g żelatyny i 1 g CrKSO44x 12 H2O w 1 litrze wody na płycie grzejnej (doprowadzić prawie do wrzenia, proces trwa około 2 godzin). Zanurzyć dobrze umyte (detergentem) i wypłukane (dH2O)2O) slajdy w uchwytach umieścić w roztworze żelatyny i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu pod przykryciem z folii przez noc. Suszarka laboratoryjna (70°C; do tego celu dobrze nadają się stare piecyki próżniowe, które były wykorzystywane do suszenia filtrów nitrocelulozowych). Mikrotom umożliwiający wykonywanie ultracienkich przekrojów (0,5-1 μprzekroje o grubości m), np. takie, jakie są stosowane w pracowniach mikroskopii elektronowej. Używamy ultramikrotomu Sorvall MT5000 z nożem diamentowym klasy Histo. Można również stosować noże szklane. Roztwory do fiksacji: Przygotować roztwór stokowy 0,2 M buforu fosforanowego sodu o pH 7,2. Przygotować 2% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym sodu, pH 7,2 (można przechowywać w 4°C przez 4 tygodnie). Przygotować ilość wystarczającą do uzyskania co najmniej 200μna każdy genotyp przeznaczony do zatapiania. Przechowywać w lodzie. Roztwór osmu: 2% OsO44 w 0,1 M buforze fosforanowym sodu o pH 7,2. Przygotować tylko taką ilość, aby uzyskać 200μna każdy genotyp przeznaczony do zatopienia, ponieważ roztwór nie nadaje się do przechowywania. Przechowywać w lodzie. Glutaraldehyd i OsO44 są silnie toksyczne i należy z nimi obchodzić się z najwyższą ostrożnością w dobrze wentylowanym dygestorium. Podczas pracy z OsO4 należy stosować końcówki z filtrem4 aby zapobiec poczernieniu pipety. Odwadnianie: Przygotować roztwory etanolu o stężeniach 30%, 50%, 70%, (80%), 90% i 100%. Zaleca się schłodzenie etanolu 30%, 50% i 70% w lodzie przed użyciem. Roztwór barwiący: 1% błękit toluidynowy w 1% boraksie.
	Miękki	Twardy
Żywica A	54 g	50 g
Utwardzacz B	44,5 g	50 g
Akcelerator C	2,5 g	1,75 g
Plastyfikator D	10 g	0,75 g

Tabela 1. Przygotowanie żywicy

Aby przygotować żywicę, należy ostrożnie, lecz dokładnie wymieszać wszystkie składniki w plastikowym zlewce, używając mieszadła magnetycznego z dużym pestkiem. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Po wymieszaniu odmierzyć odpowiednie porcje do standardowych fiolek scyntylacyjnych lub podobnych pojemników i zamrozić w temperaturze -20°C.°C. Do wszystkich zastosowań należy używać żywicy miękkiej, chyba że pracownia EM wymaga sformułowania twardszego. Podczas pracy z żywicą należy używać rękawiczek (w formie niepolimeryzowanej jest rakotwórcza). Aby spolimeryzować żywicę na sprzęcie i odpadach, należy ją wygrzać w temperaturze 70°C.°pozostawić w C przez noc. Odpady można następnie bezpiecznie zutylizować, a sprzęt wyczyścić i wykorzystać ponownie. Rozlaną niepolimeryzowaną żywicę można usunąć za pomocą izopropanolu.

OdczynnikiDostawcaNumer katalogowyPodkładka do muchnp. Genesee59-119GlutaraldehydSigmaG7526-10 X 10 MLOsO₄₄Polysciences, Inc.0972A-20Tlenek propylenuFisher04332-1Rękojeści do skalpeli, do ostrzy nr 3Fisher22080046Ostrza skalpela nr 11Fisher08-916-5BPipety transferoweFisher13-711-7MŻywica ACM Durcupan (R)Sigma (Fluka)44610-1EAStalowa igła sekcyjnaFisherS17346formułka do płaskiego zatapiania BEEMMikroskopia elektronowa nauk70904-12Żyletki z powłoką teflonowąMikroskopia elektronowa w naukach przyrodniczych71970Patyczki higieniczne (jałowe tampony)Fisher14-959-81Lamelki szklaneFisher12-550-143Kryszalki nr 1, 22x60 mmFisher12-531KŻelatynaFisherICN96010280$\text{K}_2\text{Cr}_2\text{O}_7$₄ dwunastowodnySigma243361Nóż diamentowy do histologii, 6 mmDiatome US60-HisBłękit toluidyny OFisherBP107-10Boraks (tetraboran sodu)FisherAC20629-1000medium montażowe DPXSigma44581-100ML

Tabela 2. Materiały