Prezentujemy protokoły wytwarzania i automatyzacji macierzy mikrozaworów opartych na elastomerowym polidimetylosiloksanie (PDMS), które nie wymagają dodatkowej energii do zamknięcia i charakteryzują się precyzyjnymi objętościami zdefiniowanymi fotolitograficznie. Przedstawiono równoległy mieszalnik o objętości subnanolitrowej oraz zintegrowany mikrofluidyczny system perfuzyjny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chip mikrofluidyczny sterowany macierzami elastomerowych mikrozaworów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zminiaturyzowane systemy mikroprzepływowe stanowią proste i skuteczne rozwiązania dla niskokosztowej diagnostyki w miejscu opieki (point-of-care) oraz wysokoprzepustowych testów biomedycznych. Stabilna kontrola przepływu i precyzyjne objętości płynów to dwa krytyczne wymagania w tych zastosowaniach. Opracowaliśmy chipy mikroprzepływowe wyposażone w macierze mikrozaworów z elastomerowego polidimetylosiloksanu (PDMS), które: 1) nie wymagają dodatkowego źródła energii do zamknięcia drogi przepływu, dzięki czemu napełnione urządzenie jest wysoce przenośne; oraz 2) umożliwiają mikrofabrykację głębokich (do 1 mm) kanałów z pionowymi ściankami bocznymi, co pozwala na uzyskanie bardzo precyzyjnych struktur.
Urządzenia oparte na mikrozaworach z PDMS składają się z trzech warstw: warstwy fluidycznej zawierającej ścieżki przepływu i mikrokomory o różnych rozmiarach, warstwy sterującej zawierającej mikrokanały niezbędne do uruchamiania ścieżek przepływu za pomocą mikrozaworów oraz środkowej cienkiej membrany z PDMS, która jest związana z warstwą sterującą. Warstwa fluidyczna i warstwy sterujące są wytwarzane metodą odlewania replikacyjnego PDMS z matryc z fotorezystu SU-8, a cienka membrana z PDMS jest tworzona poprzez wirowanie PDMS na określonej wysokości. Warstwa sterująca jest wiązana z cienką membraną z PDMS po aktywacji tlenowej obu elementów, a następnie montowana z warstwą fluidyczną. Mikrozawory są zamknięte w stanie spoczynku i mogą zostać otwarte poprzez przyłożenie podciśnienia (np. próżni instalacyjnej). Zamykanie i otwieranie mikrozaworów jest zautomatyzowane za pomocą zaworów elektromagnetycznych sterowanych przez oprogramowanie komputerowe.
W niniejszej pracy prezentujemy dwa mikrofluidyczne chipy oparte na mikrozaworach, przeznaczone do dwóch różnych zastosowań. Pierwszy chip umożliwia przechowywanie i mieszanie precyzyjnych objętości roztworów wodnych poniżej 1 nL w różnych proporcjach mieszania. Drugi chip pozwala na sterowaną komputerowo perfuzję mikrofluidycznych kultur komórkowych.
Urządzenia te są łatwe do wykonania i proste w sterowaniu. Ze względu na biozgodność PDMS, mikroczipy te mogą znaleźć szerokie zastosowanie w miniaturyzowanych testach diagnostycznych, a także w podstawowych badaniach z zakresu biologii komórki.
Protokół
Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych przy użyciu oprogramowania CorelDraw lub AutoCAD
Zasada działania urządzeń opartych na mikrozaworach z PDMS: Urządzenia składają się z trzech warstw: warstwy fluidycznej zawierającej mikrobiorniki o różnych rozmiarach, „warstwy sterującej” zawierającej mikrokanały niezbędne do aktywowania ścieżki fluidycznej za pomocą mikrozaworów oraz środkowej, cienkiej membrany z PDMS, która jest połączona z warstwą sterującą. W stanie spoczynku, ze względu na podatność i hydrofobowość PDMS, membrana (odwracalnie) uszczelnia gniazdo, dzięki czemu komory pozostają od siebie odizolowane bez dostarczania energii. Zawory można otwierać poprzez przyłożenie ciśnienia ujemnego (np. próżni instalacyjnej), co powoduje odgięcie membrany z PDMS w dół i jej oddzielenie od powierzchni wspierającej ściankę między dwiema komorami fluidycznymi, co w ten sposób łączy ścieżkę fluidyczną. Zamknięcie zaworu odbywa się poprzez zmianę ustawienia ciśnienia z próżni na ciśnienie atmosferyczne.
Wzory warstwy płynowej i warstwy sterującej zostały zaprojektowane przy użyciu oprogramowania CorelDraw lub AutoCAD. Maski zawierające te projekty zostały wydrukowane w wysokiej rozdzielczości (od 8 000 do 20 000 dpi) na foliach przezroczystych za pośrednictwem usług komercyjnych (CAD/Art services, Bandon, OR) (maski nie pokazane).
Wytwarzanie matryc krzemowych przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8
- Do stworzenia „matryc” z SU-8 (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) dla warstwy mikrofluidycznej i warstwy sterowania zaworami zastosowano standardowe metody fotolitografii SU-8 w pomieszczeniu czystym (nie pokazano w tym filmie).
- Aby ułatwić oddzielenie, przed replikacją w PDMS matryce z SU-8 poddano silanizacji poprzez ekspozycję na opary fluorosilanu ((tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilan (TFOCS)) w słoiku z deskrykatorem (bez granulek osuszających) podłączonym do źródła próżni. Ze względu na korozyjny charakter oparów TFOCS, komora deskrykatora musi znajdować się w dygestorium.
- Wewnątrz komory deskrykatora należy umieścić niewielki fragment chłonnego ręcznika papierowego. Na ręcznik papierowy należy nanieść kroplę TFOCS, a następnie odessać powietrze z komory. Próżnię należy stosować przez 1 min, po czym ją wyłączyć. Zamknąć dopływ próżni i pozostawić na 30 min w celu osadzenia warstwy. Matryce należy przechowywać w zamkniętych pojemnikach do późniejszego użycia.
Odlewanie replik PDMS z matryc
- Warstwę fluidyczną oraz warstwę sterującą wykonuje się metodą odlewania replikacyjnego PDMS z matryc SU-8.
- Po dokładnym wymieszaniu prepolimeru PDMS i utwardzacza (stosunek masowy 10:1), odgazowuje się mieszaninę w deskryptorze przez 10-15 min, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Silikonowe rurki należy pociąć na kawałki o długości 1-2 cm. Należy dobrać odpowiednią średnicę rurek w zależności od zastosowania. W niniejszym protokole stosujemy rurki o średnicy wewnętrznej 1,14 mm, aby ułatwić późniejsze połączenie z rurkami o średnicy zewnętrznej 1/16 cala.
- Za pomocą kleju Duco® Cement należy przykleić rurki do obszarów wlotowych matrycy SU-8 warstwy sterującej. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju, ponieważ rurki silikonowe są wykonane z tych samych komponentów co PDMS i zostaną one zatopione w mikrofluidycznym urządzeniu z PDMS, tworząc szczelne wloty i wyloty dla powietrza i cieczy.
- W naszym urządzeniu obszary wlotowe są zaprojektowane na maskach obu warstw – fluidycznej i sterującej, jednak wloty z rurek silikonowych są odlewane tylko w jednej warstwie urządzenia (na przykład w warstwie sterującej). Aby utworzyć wloty do warstwy fluidycznej, ręcznie usuwamy lub przebijamy fragmenty membrany pokrywające obszary wlotowe. Dzięki temu, po wyrównaniu i montażu, wszystkie mikrokanały (zarówno te prowadzące przepływ, jak i te sterujące zaworami) są dostępne od góry urządzenia, co sprawia, że dolna powierzchnia jest płaska, umożliwiając obrazowanie urządzenia na standardowym stoliku mikroskopu.
- Odgazowany PDMS należy ostrożnie wlać na obie matryce, w przypadku matrycy warstwy sterującej – wokół rurek. Ponownie odgazować w deskryptorze. Po zakończeniu odgazowania umieścić w piekarniku w temperaturze 65°C na > 1 godzinę w celu utwardzenia.
- Wyjąć z piekarnika matryce pokryte utwardzonym PDMS.
- Wyciąć poszczególne urządzenia z matryc (każda matryca zawiera trzy identyczne urządzenia) i je odkleić.
- Usunąć klej z obszarów wlotowych za pomocą igły lub pęsety.
- Przenieść warstwę sterującą z PDMS do pomieszczenia czystego (cleanroom).
Wytwarzanie cienkich membran PDMS
- Zgodnie z zasadą działania urządzenia, warstwa środkowa składa się z membrany PDMS o grubości ~12 μm.
- Wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, a następnie dodać heksan (stosunek masowy 3:1) i wymieszać za pomocą wibratora vortex.
- Przenieść pracę do pomieszczenia czystego. (Środowisko wolne od kurzu jest kluczowe dla zapewnienia braku defektów w membranach PDMS; cząsteczki kurzu mogą prowadzić do powstania otworów w membranach i/lub wadliwego związania z formą replikacyjną).
- Umieścić zylaryzowany podłoże krzemowe o średnicy 3 cali na uchwycie próżniowym wirówki Solitec. Podłoże musi zostać zylaryzowane (zderywatyzowane fluorosilanem) przed wirowaniem PDMS, aby ułatwić oddzielenie PDMS od powierzchni krzemowej. Teflonowa misa wokół uchwytu została owinięta folią plastikową w celu łatwego czyszczenia.
- Nanieść 2-3 ml mieszaniny PDMS/heksan na podłoże, używając igły 18G (aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza).
- Ustawić parametry wirowania. Wirować z prędkością 7000 rpm przez 30 sec, co pozwoli uzyskać film PDMS o grubości ~12 μm.
- Podgrzać podłoże w temperaturze 85°C przez 4 min na płycie grzejnej, aby utwardzić film PDMS.
Bondowanie i montaż wielowarstwowego urządzenia PDMS
- Umieść warstwę sterującą i membranę PDMS w komorze do plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 30 s (ciśnienie tlenu 30 psi, natężenie przepływu 3-5 SCFH, 550 W). Bezzwłocznie (w ciągu 5 minut) po aktywacji tlenowej doprowadź warstwę sterującą do kontaktu z membraną PDMS. Parametry systemu, takie jak ciśnienie tlenu, natężenie przepływu, moc plazmy i czas obróbki, są konfigurowane empirycznie w zależności od konkretnego zastosowania.
- Odczekaj 5 min, a następnie zdejmij warstwę sterującą wraz z membraną z podłoża krzemowego.
- Usuń membrany z obszarów wlotowych, aby obie warstwy – sterująca i fluidyczna – były dostępne od góry za pomocą rurek.
- Pod stereoskopem wyrównaj warstwę sterującą (z rurkami jako wlotami) z warstwą fluidyczną (płaską). Ponieważ PDMS uszczelnia się z PDMS, trwałe wiązanie nie jest wymagane.
Sterowane komputerowo otwieranie i zamykanie mikrozaworów z PDMS za pomocą próżni lub ciśnienia
- Po wyrównaniu i montażu urządzenia wstaw rurki Tygon o średnicy zewnętrznej 1/16 inch (średnica wewnętrzna 1/32 inch) do silikonowych wlotów o średnicy wewnętrznej 1,14 mm i podłącz wloty do źródeł ciśnienia lub zbiorników z płynem.
- W przypadku otwierania i zamykania zaworów ciśnienia steruje linia próżni oraz linia sprężonego powietrza, podłączone za pomocą dwóch regulatorów ciśnienia do zestawu miniaturowych trójdrożnych zaworów elektromagnetycznych.
- Zawory elektromagnetyczne są podłączone do sprzętu do akwizycji danych firmy National Instruments, sterowanego za pomocą oprogramowania Labview.
- Praca urządzenia oraz ugięcie membrany są wizualizowane za pomocą kolorowej kamery CCD (SPOT RT, Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).
Równoległe mieszanie dwóch barwników o różnych kolorach w różnych określonych objętościach nanolitrowych
Prezentujemy działanie mieszalnika równoległego, który umożliwia przechowywanie i mieszanie precyzyjnych objętości roztworów wodnych w skali poniżej nanolitra w różnych proporcjach mieszania:
- Warstwa płynowa zawiera dwa układy mikrokomorek: w układzie A rozmiar mikrokomorek zmniejsza się, zaczynając od lewej strony, od 200 µm x 400 µm do 200 µm x 40 µm; A10 jest komorką o wymiarach 500 µm x 40 µm i służy wyłącznie do połączenia płynowego w układzie A; na prawo od komorki A10 znajduje się zestaw komorek o symetrycznie zwiększających się rozmiarach. Komorki w układzie B są zaprojektowane tak, aby suma objętości dowolnych dwóch sąsiadujących komorek w różnych rzędach była zawsze równa. A0, A0r oraz B10, B10r stanowią odpowiednio kontrole dla roztworów A i B bez mieszania.
- Warstwa sterująca posiada dwa niezależnie sterowane zestawy zaworów. Zestaw zaworów {V1} służy do połączenia dwóch układów komorek z ich odpowiednimi wlotami, natomiast drugi zestaw zaworów {V2} służy do połączenia każdej pary komorek w obu układach.
- Napełnij mikrokomorki, otwierając zestaw zaworów {V1}, aby umożliwić przepływ dwóch roztworów barwników odpowiednio do układów A i B. Przepływ roztworów można uzyskać ręcznie lub poprzez wytworzenie podciśnienia za pomocą zaworów elektromagnetycznych. Jeśli w mikrokomorkach powstaną pęcherzyki powietrza, można wtłoczyć więcej roztworu w celu ich usunięcia lub pozostawić urządzenie na kilka minut, aż pęcherzyki znikną dzięki przepuszczalności powietrza PDMS.
- Zamknij zestaw zaworów {V1}, aby odizolować każdą komorkę w obu układach.
- Otwórz zestaw zaworów {V2}, aby umożliwić mieszanie płynów między sąsiadującymi komorkami w różnych układach. Dla tych objętości mieszanie trwa tylko ok. 1-2 min.
- Zamknij {V2}, aby wtłoczyć płyn z powrotem do każdej komorki płynowej, co spowoduje powrót komorek do ich pierwotnego kształtu. Ponieważ oba układy płynowe są zaprojektowane z komorkami o 11 różnych rozmiarach, w jednym kroku mieszania powstaje 11 różnych proporcji mieszania.
Zintegrowany system mikrofluidyczny do sterowanego komputerowo perfuzyjnego zasilania mikrofluidycznych kultur komórkowych
Prezentujemy system mikroprzepływowy umożliwiający zautomatyzowaną perfuzję wielu roztworów do jednej komory hodowli komórkowej. Wloty są kontrolowane przez mikrozawory, które mogą być aktywowane w dowolnej sekwencji pojedynczych wlotów, w różnych kombinacjach lub wszystkie jednocześnie. Urządzenie pozwala na wytwarzanie gradientów lub mieszanin różnych roztworów.
Urządzenie to składa się również z trzech warstw: warstwy fluidycznej, warstwy sterującej oraz środkowej cienkiej membrany z PDMS.
Alternatywne etapy wykonania tego urządzenia:
- Otwory wlotowe dla kanałów płynowych i kanałów sterujących są wybijane za pomocą mikro-wybijaka Harris o średnicy 1,2 mm (Ted Pella, Inc.). Przewody są podłączane do wlotów przy użyciu stępionych igieł o rozmiarze 18 G, które są wkładane do PDMS poprzez warstwę sterującą. Pozwala to na gęstsze rozmieszczenie wlotów niż w przypadku zastosowania przewodów silikonowych. Elastyczność PDMS zapewnia szczelne zamknięcie wokół igieł, co umożliwia efektywne dostarczanie cieczy lub ciśnienia pneumatycznego.
- Jak opisano wcześniej, wiązanie cienkiej membrany PDMS z warstwą sterującą jest realizowane poprzez ekspozycję na plazmę tlenową.
- Warstwę płynową przygotowuje się metodą odlewania replikacyjnego z użyciem prepolimeru PDMS i sieciującego w stosunku 5:1, a następnie częściowo utwardza przez 25 minut w temperaturze 60°C w piecu konwekcyjnym. Na tym etapie częściowo utwardzona warstwa płynowa jest wciąż lepka, ale może zostać oddzielona od matrycy.
- Warstwa płynowa jest ręcznie wyrównywana względem wcześniej zmontowanych warstw sterującej i membrany przy użyciu stereoskopu. Zmontowane urządzenie jest następnie umieszczane na płycie grzewczej na 5 minut w temperaturze 80ºC. Następnie linie sterujące zaworami są podłączone do automatycznego sterownika, a zawory są uruchamiane poprzez przyłożenie próżni, aż membrana oddzieli się od warstwy płynowej we wszystkich gniazdach zaworów. Po „oddzieleniu” zaworów, sterownik komputerowy jest ustawiony na cykliczne otwieranie i zamykanie zaworów, podczas gdy urządzenie jest dalej utwardzane na płycie grzewczej w temperaturze 80ºC przez co najmniej 1 godzinę.
Cechy naszego zintegrowanego systemu mikrofluidycznego: Urządzenie umożliwia zautomatyzowaną perfuzję 16 różnych roztworów do komory hodowli komórkowej przy użyciu zmodyfikowanego schematu zaworowego. Konstrukcja kanałów zapewnia zrównoważenie oporności wszystkich wlotów. Nasza konstrukcja mikrozaworów izoluje roztwory i kontroluje płukanie poprzez zintegrowane kanały do szybkiego usuwania cieczy, co ogranicza kontaminację krzyżową. Można aktywować zintegrowany mikser typu herringbone w celu wytworzenia mieszanin z różnych wlotów. Dodatkowo dostępne są cztery kanały o zmiennej oporności, które można aktywować w celu zmiany szybkości przepływu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Główne zalety naszej konstrukcji mikrozaworu:
- Do zamknięcia ścieżki płynowej nie jest wymagane dodatkowe źródło energii, dzięki czemu załadowane urządzenie jest wysoce przenośne; oraz
- Urządzenie można wykonać jako repliki z PDMS z form SU-8 wzorowanych fotolitograficznie, co pozwala na mikrofabrykację głębokich (do 1 mm) kanałów z pionowymi ściankami bocznymi (tj. wysokość elementów może być określona niezależnie od ich szerokości), co przekłada się na bardzo precyzyjne detale.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant #EB003307 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering oraz przez National Science Foundation Career Award przyznany A.F.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Czyste wafle krzemowe | Materiały eksploatacyjne | Silicon Sense Inc. | 3P0110TEST | średnica 3-inch, P/Bor |
| "Matryce" zawierające wzory SU-8 | Materiały eksploatacyjne | Wykonane wewnętrznie przy użyciu standardowych procedur fotolitografii | ||
| Eksykatory (2) | Sprzęt | VWR international | 24987-048 | Jeden do silanizacji, jeden do usuwania pęcherzyków powietrza z PDMS. |
| Waga analityczna | Sprzęt | OHAUS Corp. | SC6010 | |
| Piec | Sprzęt | Sheldon Manufacturing, Inc. | 1330GM | |
| MiniVortexer | Sprzęt | VWR international | 58816-121 | |
| Wirówka do nakładania warstw (Spinner) | Sprzęt | Headway Research Inc. | PWM32 | |
| Trawiacz plazmowy | Sprzęt | Plasmatic Systems, Inc. | Plasma Preen II-973 | |
| Płyta grzejna | Sprzęt | Torre Pines Scientific | HP30A | |
| Stereomikroskop | Mikroskop | Nikon Instruments | TMZ1500 | |
| Kamera CCD | Sprzęt | Diagnostic Instruments | SPOT RT | |
| Zawory elektromagnetyczne | Sprzęt | Lee Company | LHDA0511111H | |
| Karta akwizycji danych | Sprzęt | National Instruments | PCI 6025E, CB-50LP | |
| LabView | Oprogramowanie | National Instruments | Wersja 8.0 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilan | Odczynnik | United Chemical Technologies | T2492 | Silanizację należy przeprowadzić w dygestorium chemicznym. |
| Prepolimer PDMS i utwardzacz | Odczynnik | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Heksan | Odczynnik | EMD Millipore | HX0295-6 | |
| Barwniki | Odczynnik | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | FD&C 110, 135, 150 | Niebieski #1, Żółty #5, Czerwony #3. |
| Jednorazowe pipety transferowe 3 ml | Materiały eksploatacyjne | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Chusteczki Kimwipes | Materiały eksploatacyjne | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Łódeczki ważkowe | Materiały eksploatacyjne | VWR international | 12577-027 | |
| Szpatułka drewniana (do depresji języka) | Materiały eksploatacyjne | Fisher Scientific | 11-700-555 | |
| Szalki P100 | Materiały eksploatacyjne | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Przewody silikonowe (średnica wewnętrzna (I.D.) 1.14 mm) | Materiały eksploatacyjne | Cole-Parmer | 07625-30 | |
| Przewody Tygon (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in) | Materiały eksploatacyjne | Cole-Parmer | 06418-02 | |
| Cement Duco | Materiały eksploatacyjne | Devcon Inc. | 6245 | |
| Żyletka | Narzędzia | VWR international | 55411-050 | |
| Igły | Narzędzia | Fisher Scientific | 0053482 (25 Gauge) | |
| Pinceta #5 | Narzędzia | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Probówka do wirowania 50 ml | Materiały eksploatacyjne | Fisher Scientific | 05-526B | |
| Folia uszczelniająca | Materiały eksploatacyjne | AEP Industries Inc. | 0153877 | |
| Probówki do mikrowirowania 1.5 ml | Materiały eksploatacyjne | Fisher Scientific | 05-406-16 | |
| Probówki do wirowania 15 ml | Materiały eksploatacyjne | BD Biosciences | 352097 | |
| Fioletowe rękawiczki nitrylowe bezpudrowe | Materiały eksploatacyjne | VWR international | 40101-348 | |
| Biopsyjny wycinak Harrisa 1.2 mm | Narzędzia | Ted Pella, Inc. | 15074 |
Bibliografia
- Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays. Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
