Test nakładania błony białkowej: protokół do badania interakcji między rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi białkami in vitro

Podsumowanie

Testowanie interakcji białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białka. Tutaj wprowadzamy test wiązania białko-białko in vitro, aby zbadać białko unieruchomione przez błonę za pomocą białka rozpuszczalnego. Test ten zapewnia wiarygodną metodę testowania interakcji między nierozpuszczalnym białkiem a białkiem w roztworze.

Streszczenie

Walidacja interakcji między różnymi białkami jest niezbędna do badania ich funkcji biologicznych na poziomie molekularnym. Istnieje kilka metod, zarówno in vitro, jak i in vivo, do oceny wiązania białek, a w celu uzyskania wiarygodnych informacji należy przeprowadzić co najmniej dwie metody, które uzupełniają swoje niedociągnięcia.

Dla testu in vivo, test dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) stanowi najpopularniejsze i najmniej inwazyjne podejście, które umożliwia wykrycie interakcji białko-białko w żywych komórkach, a także zidentyfikowanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek ^1,2. W tym teście niefluorescencyjne połówki N- i C-końcowe GFP lub jego wariantów są łączone z badanymi białkami, a gdy dwa białka fuzyjne zostaną połączone w wyniku oddziaływań badanych białek, sygnał fluorescencyjny jest odtwarzany^3-6. Ponieważ jego sygnał jest łatwo wykrywalny za pomocą epifluorescencji lub mikroskopii konfokalnej, BiFC stał się potężnym narzędziem wybieranym przez biologów komórkowych do badania interakcji białko-białko w żywych komórkach ³. Ten test może jednak czasami dawać fałszywie dodatnie wyniki. Na przykład sygnał fluorescencyjny może być odtworzony przez dwa fragmenty GFP ułożone w odległości nawet 7 nm od siebie z powodu bliskiego upakowania w małym przedziale subkomórkowym, a nie z powodu określonych oddziaływań⁷.

Ze względu na te ograniczenia, wyniki uzyskane za pomocą technologii obrazowania żywych komórek powinny być potwierdzone przez niezależne podejście oparte na innej zasadzie wykrywania interakcji białkowych. Testy koimmunoprecypitacji (Co-IP) lub transferazy glutationowej (GST) reprezentują takie alternatywne metody, które są powszechnie stosowane do analizy interakcji białko-białko in vitro. Jednak w tych testach badane białka muszą być łatwo rozpuszczalne w buforze, który podpiera reakcję wiązania. W związku z tym za pomocą tych technik nie można ocenić specyficznych oddziaływań obejmujących białko nierozpuszczalne.

Tutaj ilustrujemy protokół testu wiązania błony białkowej, który pozwala obejść tę trudność. W tej technice można wiarygodnie przetestować interakcję między białkami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi, ponieważ jedno z białek jest unieruchomione na macierzy błonowej. Metoda ta, w połączeniu z eksperymentami in vivo, takimi jak BiFC, zapewnia wiarygodne podejście do badania i charakteryzowania interakcji między białkami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi. W tym artykule wykazano wiązanie między białkiem ruchowym (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV), które pełni wiele funkcji podczas transportu wirusa z komórki^{do komórki 8-14}, a niedawno zidentyfikowanym roślinnym interaktorem komórkowym, białkiem zawierającym powtórzenia ankyryny tytoniu (ANK) ¹⁵, przy użyciu tej techniki.

Protokół

1. Ekspresja i ekstrakcja białek

1. Różnicowo oznacz białka, które mają być testowane pod kątem ich wykrywania. Oznacz białko, które ma zostać unieruchomione na błonie (ProIM) znacznikiem o większym rozmiarze (np. GST), a nieskondensowany znacznik może być użyty jako unieruchomiona kontrola ujemna (ProIMnc). Oznacz białko, które ma być użyte jako rozpuszczalna sonda (ProSOL) za pomocą dużego lub małego znacznika. Połączyć ten sam znacznik z odpowiednim białkiem rozpuszczalnym w kontroli ujemnej (ProSOLnc) i włączyć do testu interakcji w celu potwierdzenia swoistości wykrytego wiązania.
2. Wybierz system ekspresji białek do ekspresji znakowanych białek, tj. E. coli, bakulowirusa itp., w zależności od wymagań dotyczących potencjalnych modyfikacji potranslacyjnych i wydajności białek.
3. Ekstrahować ProIM i ProIM_nc z wybranego organizmu (krok 1.2) za pomocą buforu ładującego SDS-PAGE (20% glicerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 6,8) zawierającego koktajl inhibitorów proteinaz. Pozostaw zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej na 15 minut, dodaj 0,5% 2-merkaptoetanolu i gotuj przez 5 minut.
4. Ekstrahować ProSOL i ProSOL_nc z wybranego organizmu (krok 1.2) przy użyciu standardowych protokołów ¹⁶. Białka te powinny być łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 % BSA, 0,1% Tween 20) zastosowanym w kroku 4.1.
5. Oznaczyć stężenie rekombinowanych białek za pomocą standardowej metody, takiej jak zestaw do oznaczania białek Bio-Rad. taki jak zestaw do oznaczania białek Bio-Rad. Jeżeli do badania używa się ekstraktu surowego, a nie białka oczyszczonego, należy oszacować stężenie białka będącego przedmiotem zainteresowania w tym ekstrakcie, skanując densytometrię odpowiedniego pasma na żelu poliakrylamidowym SDS barwionym błękitem brylantowym Coomassie R-250 i stosując znane stężenia BSA jako odniesienie.

2. Unieruchomienie ProIM i ProIMnc na membranie

1. Rozpuścić dwa zestawy ekstraktów, z których każdy zawiera 1 μg ProIM i ProIM_nc na żelu poliakryloamidowym SDS zgodnie ze standardowym protokołem ¹⁶.
2. Po elektroforezie umieścić transfer żelu w 100 ml buforu transferowego (60 mM glicyny, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Elektrotransferować białka zawarte w żelu do membrany nitrocelulozowej zgodnie ze standardowym protokołem ¹⁶.

3. Ponowne fałdowanie białek związanych z błoną

1. Po elektrotransferze inkubować membranę przez 15 minut w 15 ml buforu A (30 mM Tris-HCl pH7,4, 0,05% Tween 20) z delikatnym mieszaniem w celu usunięcia pozostałości SDS.
2. Po ostrożnym odsączeniu przenieść membranę do 25 ml buforu denaturacyjnego (7 M chlorowodorek guanidyny, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3 ). i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. (Uwaga: Membrana nitrocelulozowa staje się nieprzezroczysta podczas inkubacji w buforze denaturacyjnym). i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
3. Przenieść membranę do 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 5 minut (Uwaga: podczas tego etapu membrana odzyskuje swój pierwotny biały kolor).
4. Przenieść membranę do 25 ml buforu wiążącego (patrz krok 1.2) i inkubować w temperaturze 4°C z delikatnym mieszaniem przez noc.

4. Sondowanie ProIM przez ProSOL

1. Przeciąć membranę na dwa paski, oba zawierające ProIM i ProIM_nc.
2. Roztwory hybrydyzacyjne ProSOL i ProSOLnc należy sporządzić rozcieńczając preparat 1-10 μg ProSOL lub ProSOLnc w 10 ml świeżego buforu wiążącego. Przenieść każdą membranę do roztworu hybrydyzacyjnego ProSOL lub ProSOLnc i inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
3. Usunąć membrany z roztworów hybrydyzacyjnych i płukać trzy razy przez 15 minut każdy w TBS.

5. Wizualizacja interakcji białko-białko za pomocą immunoblottingu

1. Zablokuj membranę 2,5% odtłuszczonym mlekiem w TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (przeciwciało poliklonalne królika anty-strepII przeciw paciorkowcowi) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST w stężeniu zalecanym przez producenta.
2. Umieścić zablokowane błony w roztworze przeciwciała i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C z delikatnym mieszaniem.
3. Płukać błony w 20 ml TBST przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
4. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało anty-królicze IgG) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST w stężeniu zalecanym przez producenta. Umieścić błony w roztworze przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
5. Płukać błony w 20 ml TBST przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając. Po końcowym płukaniu w TBS zobrazuj interakcję białko-białko za pomocą substratu chemiluminescencyjnego HRP (na przykład zachodniego chemiluminescencyjnego podłoża HRP Millipore Immobilon).
6. Zbadaj te same błony z przeciwciałem pierwszorzędowym dla znacznika sprzężonym z ProIM, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, jak opisano w krokach 5.1 do 5.4. Wizualizuj ProIM i ProIMnc zgodnie z opisem w kroku 5.5, aby zweryfikować tożsamość prążków uzyskanych w teście nakładania błony białkowej (krok 5.5). W większości przypadków usuwanie izolacji nie jest konieczne, ponieważ sygnał uzyskany w tym kroku jest znacznie silniejszy niż sygnał szczątkowy uzyskany w kroku 5.5.

6. Reprezentatywne wyniki:

Interakcja ANK-MP została zaobserwowana przez BiFC w komórkach naskórka tytoniu (Rysunek 1A). Ponieważ MP jest białkiem wysoce nierozpuszczalnym, gdy ulega ekspresji w bakteriach lub roślinach, zastosowano test nakładania błony białkowej w celu walidacji tej interakcji in vitro (Figura 1B). Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg GST-MP (ProIM) lub nieskondensowanego GST (ProIM_nc) rozpuszczano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie elektrotransferu do membrany nitrocelulozowej. Kiedy te ProIM były sondowane rozpuszczalnym ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, ale nie niestopiony GST, wykazywał wiązanie (Rysunek 1B, tory 1, 2, porównaj z liniami 5, 6). Ponadto, gdy ten sam zestaw ProIM badano za pomocą niepowiązanego ProSOLnc, tj. Cytoplazmatycznej kinazy NADH znakowanej raskinką Arabidopsis strepII (NADH3-strepII), nie zaobserwowano żadnego wiązania, co dodatkowo dowodzi specyficzności interakcji ANK-MP (Figura 1B, pasy 3, 4).

Rysunek 1. Specyficzne wiązanie tytoniu ANK z TMV MP in vivo i in vitro. (A) Interakcja ANK-MP w żywych komórkach naskórka tytoniu wykryta przez BiFC. Silny sygnał YFP został zrekonstruowany, gdy MP i ANK, połączone odpowiednio z C-końcową i N-końcową połówką YFP, uległy koekspresji w naskórku tytoniu po mikrobombardowaniu ich genów kodujących. Ten sygnał BiFC kumuluje się w puncta na obrzeżach komórki, które są diagnostyczne dla plazmodesmatów ¹⁵. (B) Interakcja ANK-MP in vitro wykryta za pomocą testu nakładania błony białkowej. Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg GST-MP (ProIM) lub nieskondensowanego GST (ProIMnc) rozpuszczano na 15% żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie elektrotransferowano na membranę nitrocelulozową. GST-MPProIM i GSTProIMnc inkubowano z 0,5 μg / ml ANK-strepII (ProSOL), a wiązanie ANK wykryto poprzez sondowanie błony z króliczym przeciwciałem poliklonalnym anty-strepII, a następnie przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG + M sprzężonym z HRP (pasy 1 i 2). Ani GST-MPProIM, ani GSTProIMnc nie oddziaływały z niepowiązanym białkiem, cytoplazmatyczną kinazą NADH Arabidopsis, połączoną ze znacznikiem paciorkowca II (ProSOLnc, pasy 3 i 4). Tożsamość pasma zaobserwowanego w tym teście została potwierdzona przez sondowanie błony przeciwciałem anty-GST (pasy 5 i 6). Gdy błona została potraktowana buforem denaturacyjnym bez przemywania buforem A, wiązanie GST-MP z ANK zostaje utracone, podczas gdy niezidentyfikowane białka zawarte w ekstraktach białkowych GST-MP i GST reagują z ANK-strepII, co pokazuje znaczenie kroku 3.1 przed procesem denaturacji (tory 7 i 8).

Dyskusja

Podejście to jest odpowiednie do badania interakcji białko-białko między kombinacjami białek, gdy co najmniej jedno z nich jest łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym i zostało z powodzeniem zastosowane do innych kombinacji białek ^17,18. Interakcje między białkami, które są nierozpuszczalne w tych warunkach, nie mogą być badane za pomocą tego protokołu.

Również pomyślne ponowne składanie ProIM ma kluczowe znaczenie dla testu. Płukanie membrany w TBS po elektrotransferze jest kluc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania białek	Bio-Rad	500-0001
Koktajl inhibitorów proteinaz	Sigma-Aldrich	S8820
System Mini-PROTEAN	Bio-Rad	165-8000
Półsuchy system elektrotransferu SD do blottingu	zachodniego Bio-Rad	170-3940
Przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z peroksydazą chrzanu	GenScript	A00098
Przeciwciało poliklonalne królika anty-GST	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
BioTrace, membrana transferowa nitrocelulozy NT	Pall Corporation	27377-000
Immobilon zachodni chemiluminescencyjny substrat HRP	EMD Millipore	WBKL S0 050