Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2961

⸱

14 sierpnia 2011

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Streszczenie

Walidacja oddziaływań między różnymi białkami jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznych na poziomie molekularnym. Istnieje kilka metod, zarówno in vitro, jak i in vivo, służących do oceny wiązania białek; aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy zastosować co najmniej dwie metody, które wzajemnie uzupełniają swoje niedoskonałości.

W przypadku analiz in vivo, test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) stanowi najpopularniejszą i najmniej inwazyjną metodę umożliwiającą wykrywanie oddziaływań białko-białko w żywych komórkach, a także identyfikację wewnątrzkomórkowej lokalizacji oddziałujących białek 1,2. W tym teście niefluorescencyjne połowy N- i C-terminalne GFP lub jego wariantów są łączone z badanymi białkami; gdy dwa białka fuzyjne zostaną zbliżone do siebie w wyniku oddziaływań białek badanych, sygnał fluorescencyjny zostaje zrekonstruowany3-6. Ponieważ jego sygnał jest łatwo wykrywalny za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej, BiFC stało się potężnym i preferowanym narzędziem biologów komórkowych do badania oddziaływań białko-białko w żywych komórkach 3. Test ten może jednak czasami dawać wyniki fałszywie dodatnie. Na przykład sygnał fluorescencyjny może zostać zrekonstruowany przez dwa fragmenty GFP rozmieszczone w odległości do 7 nm od siebie z powodu gęstego upakowania w małym przedziale subkomórkowym, a nie w wyniku specyficznych oddziaływań7.

Ze względu na te ograniczenia, wyniki uzyskane za pomocą technologii obrazowania żywych komórek powinny zostać potwierdzone niezależną metodą opartą na innej zasadzie wykrywania oddziaływań białkowych. Koimmunoprecypitacja (Co-IP) lub testy pull-down z wykorzystaniem S-transferazy glutationowej (GST) stanowią takie alternatywne metody, powszechnie stosowane do analizy oddziaływań białko-białko in vitro. Jednak w tych testach badane białka muszą być łatwo rozpuszczalne w buforze stosowanym do reakcji wiązania. W związku z tym specyficznych oddziaływań z udziałem białka nierozpuszczalnego nie można ocenić za pomocą tych technik.

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół testu wiązania metodą nakładania białek na membranę (protein membrane overlay binding assay), który pozwala uniknąć tych trudności. W tej technice można wiarygodnie badać oddziaływania między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi, ponieważ jedno z białek zostaje unieruchomione na macierzy membranowej. Metoda ta, w połączeniu z eksperymentami in vivo, takimi jak BiFC, stanowi niezawodne podejście do badania i wiernego charakteryzowania oddziaływań między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi. W niniejszym artykule, przy użyciu tej techniki, zademonstrowano wiązanie między białkiem ruchu (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV), które pełni wiele funkcji podczas transportu wirusa z komórki do komórki8-14, a niedawno zidentyfikowanym roślinnym interaktorem komórkowym – białkiem tytoniu zawierającym powtórzenia ankyryny (ANK) 15.

Protokół

1. Ekspresja i ekstrakcja białek

  1. Zastosuj zróżnicowane znaczniki dla białek przeznaczonych do testów w celu ich detekcji. Białko, które ma zostać unieruchomione na błonie (ProIM), oznakuj znacznikiem o większym rozmiarze (np. GST); niepołączony znacznik może służyć jako unieruchomiona kontrola negatywna (ProIMnc). Białko wykorzystywane jako sonda rozpuszczalna (ProSOL) oznakuj znacznikiem dużym lub małym. Ten sam znacznik połącz z odpowiednim rozpuszczalnym białkiem kontrolnym (ProSOLnc) i uwzględnij w badaniu oddziaływań, aby potwierdzić specyficzność wykrytego wiązania.
  2. Wybierz system ekspresji białek do otrzymania białek znaczników, np. E. coli, bakulowirusy itp., w zależności od wymagań dotyczących potencjalnych modyfikacji potranslacyjnych oraz oczekiwanej wydajności białek.
  3. Wyizoluj ProIM i ProIMnc z wybranego organizmu (krok 1.2), używając buforu do aplikacji na SDS-PAGE (20% glicerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) zawierającego koktajl inhibitorów proteinaz. Pozostaw zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 15 min, dodaj 0,5% 2-merkaptoetanolu i gotuj przez 5 min.
  4. Wyizoluj ProSOL i ProSOLnc z wybranego organizmu (krok 1.2), stosując standardowe protokoły 16. Białka te powinny być łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 % BSA, 0.1% Tween 20) wykorzystywanym w kroku 4.1.
  5. Wyznacz stężenie białek rekombinowanych standardową metodą, np. za pomocą zestawu do oznaczania białek Bio-Rad. Jeśli do analizy używany jest ekstrakt surowy zamiast oczyszczonego białka, oszacuj stężenie badanego białka w tym ekstrakcie za pomocą densytometrii skanującej odpowiadającego mu prążka na żelu SDS-poliakrylamidowym barwionym Coomassie Brilliant Blue R-250, przyjmując znane stężenia BSA jako referencyjne.

2. Immobilizacja ProIM i ProIMnc na membranie

  1. Rozdziel dwa zestawy ekstraktów, z których każdy zawiera 1 μg ProIM i ProIMnc, na żelu poliakrylamidowym SDS zgodnie ze standardowym protokołem 16.
  2. Po elektroforezie umieść żel w 10 ml buforu do transferu (60 mM glicyny, 10 mM Tris, 0,006% SDS, 20% MeOH) i inkubuj przy łagodnym mieszaniu przez 20 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieś białka zawarte w żelu na membranę nitrocelulozową metodą elektrotransferu zgodnie ze standardowym protokołem 16.

3. Refolding białek błonowych

  1. Po elektrotransferze inkubować membranę przez 15 min w 15 ml buforu A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0.05% Tween 20) przy łagodnym mieszaniu w celu usunięcia pozostałości SDS.
  2. Po ostrożnym odlaniu cieczy przenieść membranę do 25 ml buforu denaturującego (7 M guanidyny chlorowodorku, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8.3) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. (Uwaga: membrana nitrocelulozowa staje się nieprzezroczysta podczas inkubacji w buforze denaturującym). i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
  3. Przenieść membranę do 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) i inkubować przy łagodnym mieszaniu przez 5 min (Uwaga: podczas tego kroku membrana odzyskuje swój pierwotny biały kolor).
  4. Przenieść membranę do 25 ml buforu wiążącego (patrz krok 1.2) i inkubować w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu przez noc.

4. Badanie ProIM za pomocą ProSOL

  1. Przetnij błonę na dwa paski, z których każdy zawiera ProIM i ProIMnc.
  2. Przygotuj roztwory hybrydyzacyjne ProSOL i ProSOLnc poprzez rozcieńczenie 1-10 μg ProSOL lub ProSOLnc w 10 ml świeżego buforu wiążącego. Przenieś każdą błonę do odpowiedniego roztworu hybrydyzacyjnego ProSOL lub ProSOLnc i inkubuj przez 1,5 h w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
  3. Wyjmij błony z roztworów hybrydyzacyjnych i przemyj trzykrotnie w TBS, po 15 min każdy raz.

5. Wizualizacja oddziaływań białko-białko za pomocą immunoblotingu

  1. Zablokować membranę, używając 2,5% mleka odtłuszczonego w TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalne królicze przeciwciało anty-strepII) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z koncentracją zalecaną przez producenta.
  2. Umieścić zablokowane membrany w roztworze przeciwciał i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C przy delikatnym mieszaniu.
  3. Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 min, a następnie dwukrotnie po 5 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało anty-rabbit IgG) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w 0,5% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z koncentracją zalecaną przez producenta. Umieścić membrany w roztworze przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.
  5. Płukać membrany w 20 ml TBST przez 15 min, a następnie dwukrotnie po 5 min w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Po końcowym płukaniu w TBS zwizualizować oddziaływanie białko-białko, stosując substrat chemiluminescencyjny HRP (na przykład Millipore Immobilon western chemiluminescent HRP substrate).
  6. Przebrać te same membrany przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko znacznikowi połączonemu z ProIM, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, zgodnie z opisem w krokach od 5.1 do 5.4. Zwizualizować ProIM oraz ProIMnc zgodnie z opisem w kroku 5.5, aby potwierdzić tożsamość prążków uzyskanych w teście overlay białkowo-białkowym (krok 5.5). W większości przypadków stripping nie jest konieczny, ponieważ sygnał uzyskany w tym kroku jest znacznie silniejszy niż sygnał resztkowy z kroku 5.5.

6. Reprezentatywne wyniki:

Interakcję ANK-MP zaobserwowano za pomocą metody BiFC w komórkach epidermy tytoniu (Rycina 1A). Ponieważ MP jest białkiem wysoce nierozpuszczalnym podczas ekspresji w bakteriach lub roślinach, w celu walidacji tej interakcji in vitro zastosowano test nakładania białek na błonę (protein membrane overlay assay) (Rycina 1B). Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg GST-MP (ProIM) lub niepołączonego GST (ProIMnc) rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu SDS-poliakrylamidowym, a następnie przeprowadzono elektrotransfer na błonę nitrocelulozową. Gdy te ProIM poddano inkubacji z rozpuszczalnym ANK-strepII (ProSOL), wiązanie wykazano dla GST-MP, ale nie dla niepołączonego GST (Rycina 1B, ścieżki 1, 2, porównać ze ścieżkami 5, 6). Co więcej, gdy ten sam zestaw ProIM poddano inkubacji z niepowiązanym ProSOLnc, tj. cytokalizatorową NADH kinazą z Arabidopsis z tagiem strepII (NADH3-strepII), nie zaobserwowano wiązania, co dodatkowo potwierdziło specyficzność interakcji ANK-MP (Rycina 1B, ścieżki 3, 4).

Analiza ekspresji białek z wykorzystaniem mikroskopii i immunoblotingu; mikroskopia fluorescencyjna i elektroforeza żelowa.
Rycina 1. Specyficzne wiązanie białka ANK tytoniu z białkiem MP TMV in vivo i in vitro(A) Interakcja ANK-MP w żywych komórkach epidermy tytoniu wykryta metodą BiFC. Silny sygnał YFP został odtworzony, gdy MP i ANK, połączone odpowiednio z częściami C-końcową i N-końcową YFP, były koekspresowane w epidermie tytoniu po mikrobombardowaniu genami kodującymi te białka. Sygnał BiFC gromadził się w postaci punktów na obwodzie komórki, co jest charakterystyczne dla plazmodesmat. 15(B) Interakcja ANK-MP in vitro wykryte za pomocą testu nakładania białek na błonę (protein membrane overlay assay). Ekstrakty białkowe zawierające 1 μg białek GST-MP (ProIM) lub niepołączonego GST (ProIMnc) rozdzielono na 15% żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie przeniesiono drogą elektrotransferu na membranę nitrocelulozową. Białka GST-MPProIM oraz GSTProIMnc inkubowano z 0.5 μg/ml białka ANK-strepII (ProSOL), a wiązanie ANK wykryto poprzez inkubację membrany z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-strepII, a następnie z wtórnym przeciwciałem anty-króliczym IgG+M sprzężonym z HRP (ścieżki 1 i 2). Żaden z białek, GST-MPProIM ani GSTProIMnc, nie wchodził w interakcję z białkiem niepowiązanym, Arabidopsis cytoplazmatyczna kinaza NADH, połączona z tagiem strepII (ProSOLnc, ścieżki 3 i 4). Tożsamość prążka zaobserwowanego w tym badaniu potwierdzono za pomocą przeciwciała anty-GST w analizie western blot (ścieżki 5 i 6). Gdy membranę potraktowano buforem denaturującym bez uprzedniego przemycia buforem A, wiązanie GST-MP z ANK uległo zanikowi, natomiast niezidentyfikowane białka zawarte w ekstraktach GST-MP oraz ekstraktach białek zawierających GST zareagowały z ANK-strepII, co dowodzi znaczenia kroku 3.1 przed procesem denaturacji (ścieżki 7 i 8).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podejście to jest odpowiednie do badania oddziaływań białko-białko pomiędzy kombinacjami białek, w których przynajmniej jedno z białek jest łatwo rozpuszczalne w buforze wiążącym, i zostało z powodzeniem zastosowane w odniesieniu do innych kombinacji białek 17,18. Oddziaływań pomiędzy białkami, które w tych warunkach są oba nierozpuszczalne, nie można badać za pomocą niniejszego protokołu.

Ponadto, pomyślne refoldowanie ProIM jest krytyczne dla przeprowadzenia testu. Płukanie membra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Prace w naszym laboratorium są wspierane grantami z NIH, USDA National Institute of Food and Agriculture, NSF, BARD, DOE oraz BSF przyznanymi V.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białkaBio-Rad500-0001
Koktajl inhibitorów proteinazSigma-AldrichS8820
System Mini-PROTEANBio-Rad165-8000
Półsuchy system elektrotransferu SD do western blottinguBio-Rad170-3940
Przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z peroksydazą chrzanowąGenScriptA00098
Poliklonalne przeciwciało królicze anty-GSTGenScriptA00097
Anti-strepIIGenScriptA00626
BioTrace, membrana nitrocelulozowa do transferu NTPall Corporation27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrateEMD MilliporeWBKL S0 050

Bibliografia

  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
  2. Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
  3. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  4. Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
  5. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
  6. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
  7. Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
  8. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
  9. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  10. Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
  11. Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
  12. Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
  13. Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
  14. Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
  15. Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
  16. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
  17. Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
  18. Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oddziaływania białko-białkowiązanie białek rozpuszczalnychdetekcja białek nierozpuszczalnychunieruchomienie na błonie nitrocelulozowejbiałka z tagiem GSTdetekcja metodą Western blotsonda Strep-Taganaliza wiązania in vitrowalidacja BiFC
Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.