Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Indukcja SE
- Kup 8-tygodniowego samca myszy C57BL/6NHsd i zważ każdą mysz. Następnie użyj markera, aby oznaczyć ogony wszystkich myszy, aby ułatwić ich identyfikację podczas indukcji SE.
- Obliczyć ilość bromku metylu skopolaminy (skopolaminy; 2 mg/kg), hemisulfanu terbutaliny (terbutaliny; 2 mg/kg) i chlorowodorku pilokarpiny (pilokarpiny; 280 mg/kg) na podstawie masy ciała myszy i dodać sól fizjologiczną (0,9% NaCl, 10 ml/kg) w celu uzyskania roztworów.
UWAGA: Na przykład, jeśli waga myszy wynosi 25 g, stosuje się następujące ilości: skopolamina i terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1,000 g) = 0,05 mg, sól fizjologiczna: 10 ml/kg * (25 g/1,000 g) = 0,25 ml, pilokarpina: 280 mg/kg * (25 g/1,000 g) = 7 mg, sól fizjologiczna: 10 ml/kg * (25 g/1,000 g) = 0,25 ml.
- Mieszaninę skopolaminy i terbutaliny należy umieścić w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 30 G. Wstrzyknąć roztwór dootrzewnowo każdej myszy, a następnie umieścić myszy z powrotem w klatkach. Po 30 minutach od podania skopolaminy i terbutaliny wstrzyknąć roztwór pilokarpiny każdej myszy (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 30 G). Bezpośrednio po wstrzyknięciu pilokarpiny należy umieścić myszy w inkubatorze (28–30°C) w celu obserwacji.
- Uważnie monitoruj zachowanie myszy, aż do momentu wywołania SE. Jeśli zostaną wykryte napady limbiczno-ruchowe, które odpowiadają etapowi 3 lub wyższemu zgodnie ze skalą Racine'a, rejestruj czas i monitoruj myszy, aby określić, czy napady występują częściej. Gdy ciągłe napady motoryczne trwają dłużej niż 2 minuty, umieść mysz w nowej klatce w temperaturze pokojowej i monitoruj przez 3 godziny, aby ustalić, czy ich napady konwulsyjne trwają nadal i czy wywołane jest SE. Poddaj eutanazji myszy, które nie dostały się do SE po około 2 godzinach od wstrzyknięcia pilokarpiny.
UWAGA: Skala Racine'a; etap 1, ruchy ust i twarzy; etap 2, głową; etap 3, klonus kończyny przedniej; etap 4, odchów z klonusem kończyn przednich; Etap 5, podnoszenie i opadanie z klonusem kończyn przednich. Jeśli mysz nie zostanie przeniesiona do klatki w temperaturze pokojowej natychmiast po indukcji SE, mysz może umrzeć z powodu hipertermii.
- Ostre napady behawioralne należy zakończyć po 3 godzinach od wystąpienia SE poprzez wstrzyknięcie roztworu diazepamu (i.p.; 10 mg/kg; strzykawka 1 ml; igła 30 G). Przygotować roztwór diazepamu, rozcieńczając 5 mg/ml diazepamu w 10% uwodornionym oleju rycynowym polioksylowym 35, dodając sól fizjologiczną (i.p.; 10 ml/kg; 1 ml strzykawka; igła 30 G).
UWAGA: 10% polioksylo-35 uwodorniony roztwór oleju rycynowego: 1 ml polioksylo-35 uwodornionego roztworu oleju rycynowego + 9 ml soli fizjologicznej. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Na przykład, jeśli masa ciała myszy wynosi 25 g, wstrzyknij 250 μl roztworu diazepamu: 50 μl 5 mg/ml diazepamu + 200 μl 10% polioksylo-35 uwodornionego roztworu oleju rycynowego = 250 μl 1 mg/ml diazepamu.
- W przypadku myszy pozorowanych należy wykonać wstrzyknięcie dożylnie mieszaniny bromku metylu skopolaminy i półsiarczanu terbutaliny (i.p.; oba 2 mg/kg, 10 mL/kg; strzykawka 1 ml; igła 30 G). 30 minut później wstrzyknąć sól fizjologiczną dootrzewnowo (i.p.; 10 ml / kg; 1 ml strzykawka; igła 30 G).
UWAGA: Jeśli masa ciała myszy wynosi 25 g, wstrzyknij 250 μl soli fizjologicznej zamiast pilokarpiny.
- Po wstrzyknięciu diazepamu (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 30 G) należy podać 1 ml 5% dekstrozy na pojedynczą mysz (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G).
UWAGA: 1 ml 5% dekstrozy do wstrzykiwań zapewnia źródło energii i nawodnienie, które mogą zwiększyć wskaźnik przeżycia.
- Podczas pielęgnacji w inkubatorze (28–30 °C) należy zetrzeć nadmierną ilość wydzieliny, takiej jak ślina, łzy i kał.
- W 1. dniu po indukcji SE zważyć myszy i trzymać je w inkubatorze (28–30 °C) przez dodatkowy dzień. W 2 dniu, po indukcji SE, zważ myszy i umieść je z powrotem w klatce domowej. Zapewnij im wilgotną karmę, aby ułatwić im regenerację.
UWAGA: W tym eksperymencie śmiertelność dla C57BL / 6NHsd po zakończeniu SE wynosiła średnio 8,57% (3 z 35 testowanych myszy).
- Zmierz dzienną masę ciała zwierząt do 7 dni po pilokarpinie i wstrzyknij myszom 5% dekstrozy (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G), gdy masa ciała nie wzrosła. Przerwij monitorowanie masy ciała, gdy myszy zaczną odzyskiwać masę ciała i bez trudu spożywać wilgotną karmę po 2 dniach od wstrzyknięcia pilokarpiny.
UWAGA: Jeśli masa ciała myszy nie wzrosła do 7 dni po SE, wyklucz mysz z eksperymentu i poddaj ją eutanazji dwutlenkiem węgla. W zależności od tła myszy czasami może dojść do śmierci; jednak w przypadku C57BL / 6NHsd mniej niż 1% myszy zmarło w tych eksperymentach. Przy przeżyciu dłuższym niż 7 dni po indukcji SE myszy rzadko umierają w okresie utajonym.
