$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Synteza i funkcjonalizacja nanocząstek
UWAGA: Wszystkie syntezy powinny zachodzić w wentylowanym dygestoriach chemicznych.
- Przed syntezą przefiltruj około 300 ml wody dejonizowanej (DI) przez sterylny filtr 0,2 μm.
- Wyczyść szklaną kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml roztworem detergentu i spłucz wodą DI. Dodaj 0,0134 g CuCl2 do 100 ml wody DI, aby uzyskać 1 mM roztwór.
- Dodać 0,015 g kwasu foliowego (FA) do roztworu CuCl2 i mieszać przez ~5 minut za pomocą mieszadła magnetycznego.
- Dodać Na2S·9H2O (0,024 g w 100 μl wody demineralizowanej) przez około 10 s do mieszaniny reakcyjnej za pomocą pipety 200 μL.
nuta: Po dodaniu Na2S·9H2O roztwór zmieni kolor z jasnożółtego na ciemnobrązowy.
- Zamknij reakcję i umieść w łaźni olejowej nastawionej na 90 °C i kontynuuj mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego. Po około 15 minutach lub gdy kąpiel olejowa osiągnie temperaturę 85−90 °C, pozwól reakcji postępować przez dodatkową godzinę. Twoja mieszanina powinna stopniowo zmieniać kolor na ciemnozielony.
nuta: Upewnij się, że odpowietrzyłeś system podczas podgrzewania mieszaniny reakcyjnej, aby uniknąć wzrostu ciśnienia.
- Wyjąć naczynie reakcyjne z łaźni olejowej i krótko schłodzić w temperaturze pokojowej przez około 10 do 15 minut przed przeniesieniem do łaźni lodowej.
- Gdy mieszanina reakcyjna ostygnie poniżej 20 °C, dostosuj pH do 10, używając 1M NaOH, aby rozpuścić pozostały kwas foliowy w roztworze.
- Oczyść mieszaninę reakcyjną FA-CuS za pomocą kolumny wirowej o sile 30 kDa. Dodać roztwór w partiach o objętości 15 ml do kolumny i odwirować przy 3,082 x g przez 15 minut.
- Po zagęszczeniu całej mieszaniny reakcyjnej należy ponownie połączyć zagęszczone frakcje i przemyć 4x 15 ml pH 10 NaOH w kolumnie wirowej o sile 30 kDa.
- Do pomiaru masy weź 1/3 roztworu (~66 μl) i podziel na trzy szklane fiolki. Suszyć w piecu próżniowym przez noc w temperaturze 40 °C w próżni ~27 mmHg.
- Pozostałe 2/3 stężonego roztworu rozpuścić w 250 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
- Przed użyciem nanocząsteczek FA-CuS, należy je sonikować przez 30 minut w sonografie kąpielowym na wysokim ustawieniu.
2. Wychwyt NPs FA-CuS przez komórki raka jajnika
- Przed inkubacją z nanocząsteczkami FA-CuS inkubować komórki SKOV-3 w kolbie T75 z 8−15 ml pożywki RPMI-1640 bez kwasu foliowego z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny przez co najmniej 24 godziny.
- Wysiewaj komórki w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego o gęstości 0,1 x 106 komórek/ml na 24-dołkowej płytce.
- Następnego dnia inkubować komórki z 400 μg/ml FA-CuS NPS w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego przez 2 godziny.
- Po tej inkubacji trypsynuj komórki 0,5 ml 0,25% trypsyny z EDTA. Dodać co najmniej 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego, aby zneutralizować trypsynę i odwirować komórki przy 123 x g przez 6 minut.
- Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 2 ml PBS i odwirować przy 123 x g przez 6 minut. Wykonać ten etap płukania 2x, aby usunąć wszelkie niezwiązane nanocząsteczki.
- Ponownie zawiesić komórki w 1−2 ml PBS z 2% roztworem Tween .
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Ponadto rozcieńczyć komórki, jeśli liczba komórek jest zbyt wysoka. Rozcieńczyć komórki w PBS za pomocą 2% Tween do wybranego stężenia w celu wykrycia.
- Komórki są teraz gotowe do analizy przez system PAFC.