Funkcjonalizowane celowanie w nanocząstki raka jajnika: technika ułatwiająca wychwyt nanocząsteczkowego środka kontrastowego sprzężonego z kwasem foliowym przez komórki raka jajnika

Streszczenie

Źródło: Lusk, J. F. et al. Wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy technikę ułatwiającą internalizację nanocząstek siarczku miedzi z kwasem foliowym (CuS NPs). Funkcjonalizowane kwasem foliowym nanocząsteczki CuS mają zdolność celowania w receptory kwasu foliowego, które ulegają nadekspresji w wielu komórkach raka jajnika.

Protokół

1. Synteza i funkcjonalizacja nanocząstek

UWAGA: Wszystkie syntezy powinny zachodzić w wentylowanym dygestoriach chemicznych.

1. Przed syntezą przefiltruj około 300 ml wody dejonizowanej (DI) przez sterylny filtr 0,2 μm.
2. Wyczyść szklaną kolbę okrągłodenną o pojemności 250 ml roztworem detergentu i spłucz wodą DI. Dodaj 0,0134 g CuCl₂ do 100 ml wody DI, aby uzyskać 1 mM roztwór.
3. Dodać 0,015 g kwasu foliowego (FA) do roztworu CuCl₂ i mieszać przez ~5 minut za pomocą mieszadła magnetycznego.
4. Dodać Na₂S·9H₂O (0,024 g w 100 μl wody demineralizowanej) przez około 10 s do mieszaniny reakcyjnej za pomocą pipety 200 μL.
   nuta: Po dodaniu Na₂S·9H₂O roztwór zmieni kolor z jasnożółtego na ciemnobrązowy.
5. Zamknij reakcję i umieść w łaźni olejowej nastawionej na 90 °C i kontynuuj mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego. Po około 15 minutach lub gdy kąpiel olejowa osiągnie temperaturę 85−90 °C, pozwól reakcji postępować przez dodatkową godzinę. Twoja mieszanina powinna stopniowo zmieniać kolor na ciemnozielony.
   nuta: Upewnij się, że odpowietrzyłeś system podczas podgrzewania mieszaniny reakcyjnej, aby uniknąć wzrostu ciśnienia.
6. Wyjąć naczynie reakcyjne z łaźni olejowej i krótko schłodzić w temperaturze pokojowej przez około 10 do 15 minut przed przeniesieniem do łaźni lodowej.
7. Gdy mieszanina reakcyjna ostygnie poniżej 20 °C, dostosuj pH do 10, używając 1M NaOH, aby rozpuścić pozostały kwas foliowy w roztworze.
8. Oczyść mieszaninę reakcyjną FA-CuS za pomocą kolumny wirowej o sile 30 kDa. Dodać roztwór w partiach o objętości 15 ml do kolumny i odwirować przy 3,082 x g przez 15 minut.
9. Po zagęszczeniu całej mieszaniny reakcyjnej należy ponownie połączyć zagęszczone frakcje i przemyć 4x 15 ml pH 10 NaOH w kolumnie wirowej o sile 30 kDa.
10. Do pomiaru masy weź 1/3 roztworu (~66 μl) i podziel na trzy szklane fiolki. Suszyć w piecu próżniowym przez noc w temperaturze 40 °C w próżni ~27 mmHg.
11. Pozostałe 2/3 stężonego roztworu rozpuścić w 250 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
12. Przed użyciem nanocząsteczek FA-CuS, należy je sonikować przez 30 minut w sonografie kąpielowym na wysokim ustawieniu.

2. Wychwyt NPs FA-CuS przez komórki raka jajnika

1. Przed inkubacją z nanocząsteczkami FA-CuS inkubować komórki SKOV-3 w kolbie T75 z 8−15 ml pożywki RPMI-1640 bez kwasu foliowego z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny przez co najmniej 24 godziny.
2. Wysiewaj komórki w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego o gęstości 0,1 x 10⁶ komórek/ml na 24-dołkowej płytce.
3. Następnego dnia inkubować komórki z 400 μg/ml FA-CuS NPS w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego przez 2 godziny.
4. Po tej inkubacji trypsynuj komórki 0,5 ml 0,25% trypsyny z EDTA. Dodać co najmniej 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego, aby zneutralizować trypsynę i odwirować komórki przy 123 x g przez 6 minut.
5. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 2 ml PBS i odwirować przy 123 x g przez 6 minut. Wykonać ten etap płukania 2x, aby usunąć wszelkie niezwiązane nanocząsteczki.
6. Ponownie zawiesić komórki w 1−2 ml PBS z 2% roztworem Tween .
7. Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Ponadto rozcieńczyć komórki, jeśli liczba komórek jest zbyt wysoka. Rozcieńczyć komórki w PBS za pomocą 2% Tween do wybranego stężenia w celu wykrycia.
8. Komórki są teraz gotowe do analizy przez system PAFC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,025% trypsyna z EDTA	Corning	25-053-Cl
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15	Milipory	UFC903024
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4	Milipory	UFC803024
Hematocytometr jasnej linii	Hausser Scientific	Rok 1492
Chlorek miedzi(II)	ACROS ORGANICS	206532500
Cyfrowa ultradźwiękowa wanna czyszcząca serii CPX	Marka rybacka	Wzór CPX3800
Strzykawki Norm-Ject 10 ml	HENKE SASS WILK	4100-X00V0
FBS (Sieć Usługowa	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Kwas foliowy	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Pbs	Alfa Aesar	Zobacz materiał J62036
Penicylina Streptomycyna	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Rozdział 15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) Bez kwasu foliowego	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 27016-021
Ogniwa SKOV-3	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-77
Kulki wodorotlenku sodu	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH9292-500G
Siarczek sodu niewodny	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 431648-50G
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%	Amresco (angielski)	Zobacz materiał K940-100ML
Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 μm	Firma VWR	Numer katalogowy 28145-477
Preparat Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1,8 kg	Detergent używany do czyszczenia naczyń szklanych.
Animacja 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML

powiedział: