Izolacja mitochondriów: technika izolowania mitochondriów od próbki tkanki ludzkiego raka jajnika

Streszczenie

Źródło: Zhan, X. et al. Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje procedurę izolacji mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika za pomocą wirowania o różnej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradiacji gęstości. Wyizolowane mitochondria można wykorzystać do analizy proteomicznej proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika

Próbki tkanki jajnikowej, w tym tkanki raka jajnika (n = 7) zostały użyte do tego protokołu.

1. Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, mieszając 210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 100 mM chlorku potasu (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM kwasu diaminotetraoctowego (EDTA), 0,1 mM glikolu etylenowego kwasu bis(2-aminoetylowego)tetraoctowego (EGTA), 1 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 2 mM ortowanadanu sodu (V) i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), Odczyn pH 7,4.
2. Umieść ~1,5 g tkanek raka jajnika w czystym szklanym naczyniu.
3. Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.
4. Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm³ kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).
6. Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
7. Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1,300 x g, 10 min, 4 °C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.
8. Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 °C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.
9. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego i dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.
10. Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).
11. Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25% (tj. Nycodenz), aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.
12. Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 1.11), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).
13. Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 25% i 30% do czystej probówki.
14. Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.
15. Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.
16. Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C.
    nuta: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z tkanki raka jajnika jako próbkę mitochondriów do ilościowej analizy proteomicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas diaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma	Nr kat. 798681-100G	Bezwodny, sypki, Redi-Dri, ≥98%
Naziemna telewizja	Sigma	10197777001	1,4-Dithiothreito
Kwas bis(2-aminoetylowy)tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma	E0396-10G	BioXtra, ≥97,0%
Homogenizator	Cichy wstrząs	HYQ-3110
Niskotemperaturowa wirówka superobrotowa	Eppendorf	5424R
wirówka	XiangYi powiedział:	TDZ4--WS
Mannitol	Macklin	M813424-100G	Mannitol to poliol (alkohol wielowodorotlenowy) wytwarzany w wyniku uwodornienia fruktozy, który działa jako słodzik, substancja utrzymująca wilgoć i substancja wypełniająca. Ma niską higroskopijność i słabą rozpuszczalność oleju.
Inhibitor proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)	Solarbio (Słoneczna Biologia	P0100-1ML	PMSF jest inhibitorem proteazy, który reaguje z resztami seryny w celu zahamowania trypsyny, chymotrypsyny, trombiny i papainy.
Chlorek potasu	Macklin	P816354-25G	Chlorek potasu, KCI, znany również jako muriat potasu i sylwit, jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym o słonym smaku, które topi się w temperaturze 776°C (1420 OF). Jest rozpuszczalny w wodzie, ale nierozpuszczalny w alkoholu. Chlorek potasu jest stosowany w nawozach, farmaceutykach, fotografii oraz jako substytut soli

cyfrowa powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: