$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika
Próbki tkanki jajnikowej, w tym tkanki raka jajnika (n = 7) zostały użyte do tego protokołu.
- Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, mieszając 210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 100 mM chlorku potasu (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM kwasu diaminotetraoctowego (EDTA), 0,1 mM glikolu etylenowego kwasu bis(2-aminoetylowego)tetraoctowego (EGTA), 1 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 2 mM ortowanadanu sodu (V) i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), Odczyn pH 7,4.
- Umieść ~1,5 g tkanek raka jajnika w czystym szklanym naczyniu.
- Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.
- Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm3 kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).
- Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
- Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1,300 x g, 10 min, 4 °C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.
- Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 °C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.
- Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego i dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.
- Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).
- Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25% (tj. Nycodenz), aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.
- Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 1.11), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).
- Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 25% i 30% do czystej probówki.
- Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.
- Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.
- Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C.
nuta: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z tkanki raka jajnika jako próbkę mitochondriów do ilościowej analizy proteomicznej.