Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Stworzenie linii komórkowej VX2 in vitro
- Zbierz guz VX2 z mięśnia czworogłowego kości udowej królika i wzrostu w boku myszy.
- Rozmrozić zamrożone bloki nowotworowe VX2 (1 cm x 1 cm), zmielić na płytce hodowlanej za pomocą ostrza skalpela i przecedzić przez filtr 70 μm, dodając sekwencyjnie niewielkie ilości zbalansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby upewnić się, że wszystkie komórki są odcedzone do końcowej objętości 1 ml.
- Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% buforowanym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do stężenia 1 x10 7/ml i umieścić na lodzie w sterylnej probówce.
nuta: Bloki nowotworowe uzyskano od współpracownika laboratoryjnego z wcześniejszej propagacji guzów VX2 w mięśniach czworogłowych uda.
- Znieczulić samicę białego królika nowozelandzkiego (o wadze 2,5-3,5 kg) 2-5% wziewnym izofluranem, usunąć sierść pokrywającą miejsce wstrzyknięcia i oczyścić miejsce wstrzyknięcia roztworem jodu powidonu. Wstrzyknąć 500 μl przygotowanej zawiesiny komórek VX2 (5 x 106 komórek/ml) do mięśnia czworogłowego uda. Monitoruj klinicznie królika pod kątem wzrostu guza, począwszy od 10 dnia.
- Eutanazja królików po tym, jak guzy osiągną średnicę 1-1,5 cm (mierzoną zewnętrznie suwmiarką) przy użyciu metody zatwierdzonej przez lekarza weterynarii. Potwierdź eutanazję, sprawdzając parametry życiowe, w tym tętno i częstość oddechów. Wyciąć guz za pomocą sterylnych narzędzi po oczyszczeniu obszaru roztworem betadyny.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą sterylnych narzędzi zmiel guz na małe kawałki (0,2 cm) na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej za pomocą ostrza skalpela. Przepuścić fragmenty guza przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, używając 1 ml HBSS, jak opisano w kroku 1.1.1. Policz komórki i rozcieńcz 0,9% roztworem soli, aby uzyskać 7,5 x 105 komórek w 200 μl.
- Znieczulić samce myszy gamma NOD SCID (waga 25 g) za pomocą 4% izofluranu w dawce 1 l/min i utrzymać znieczulenie za pomocą 2% izofluranu. Po znieczuleniu myszy wstrzyknij 200 μl roztworu z kroku 1.1.5 do tkanki podskórnej boku myszy za pomocą igły o rozmiarze 27.
- Pobieranie i pasażowanie komórek VX2 in vitro
- Monitoruj wzrost ksenoprzeszczepu klinicznie dwa razy w tygodniu, aż guzy osiągną średnicę 1 cm za pomocą suwmiarki.
- Poddaj myszy eutanazji, umieszczając je w komorze CO2 lub wykonując zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu 4% gazem izofluranowym. Wyciąć guzy w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Zmiel guzy skalpelem na 1-2 mm kawałki w 6-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 3 ml pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Pozostaw fragmenty guza w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez dwa dni, aż komórki zaczną wyrastać z kawałków guza. Następnie codziennie sprawdzaj hodowane płytki za pomocą mikroskopii świetlnej pod kątem zbieżności komórek. Po osiągnięciu 70% zbiegu trypsynizuj komórki, dodając 1 ml 0,05% trypsyny do kolby i umieszczając z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Zneutralizować trypsynę za pomocą 6 ml pożywki DMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS, zebrać komórki i odwirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3,5 ml nowego podłoża DMEM/Ham's F12 + 10% FBS. Nasiona świeże 6 cm pokryte kolagenem I płytki 1,6 x 106 komórek na płytkę, aby osiągnąć około 50% gęstości wysiewu komórek.
UWAGA: 50% gęstości komórek odnosi się do komórek zajmujących 50% powierzchni płytki po przymocowaniu.
- Wczesne pasażowanie: Powtórz powyższy proces (trypsynazacja, wysiew), aż komórki zostaną pasażowane 5 razy, a następnie oceń czystość linii komórkowej za pomocą PCR przy użyciu ilościowego testu PCR w celu odróżnienia genomowego DNA królika od genomowego DNA myszy (patrz krok 1.3.1-1.3.4).
nuta: Po 8 pasażach komórki można rozmnażać na niepokrytych kolagenem regularnie przylegających płytkach do hodowli tkankowych.
- Pasażować, trypsynizować i zamrażać podwielokrotności komórek w DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO w stężeniu 2 x 106 na fiolkę. Przechowuj komórki w ciekłym azocie do czasu, gdy będą potrzebne do eksperymentów.
- Potwierdzenie pochodzenia VX2 komórek, które przeżyły:
- Stworzenie standardowego lekarstwa z oczyszczonego genomowego DNA myszy i królika (Krok 1.3.2 i Krok 1.3.3). Stosować startery, które są ukierunkowane na sekwencje specyficzne dla gatunku w drugiej otwartej ramce odczytu elementu retrotranspozonowego LINE-1.
nuta: Sekwencje podstawowe dla CRPV E6 to: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG i 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Zastosowano elementy retrotranspozonowe LINE-1. Sekwencje starterów dla królika LINE-1 to: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC i 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGTGT Sekwencje starterów dla myszy LINE-1 to: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG i 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- Aby utworzyć krzywą standardową dla CRPV E6, oczyść lizat komórek nowotworowych VX2 (krok 1.1.1) za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Określ ilościowo to DNA za pomocą komercyjnego testu. Wykonaj 6 seryjnych rozcieńczeń od 225 pg/μL do 0,925 pg/μL w buforze o niskiej zawartości EDTA-TE. Aby utworzyć krzywą standardową dla genomowego DNA myszy, rozcieńczyć 100 μg komercyjnego genomowego DNA myszy w buforze o niskiej zawartości EDTA-TE w 5 rozcieńczeniach od 125 pg/μL do 0,0125 pg/μL.
- Umieścić 4 μl z każdego rozcieńczonego roztworu z próbek z kroku 1.3.2 w studzienkach i uruchomić próbki w termocyklerze PCR. Użyj wartości Cq z każdego cyklu wraz z ilościami DNA na studzienkę, aby obliczyć krzywą standardową przy użyciu ustawień automatycznego progu oprogramowania termocyklera.
- Użyj standardowych procedur qPCR, aby wykonać PCR z 40 cyklami 2-etapowych cykli (98 °C i 60 °C) na termocyklerze. Ustal wartości progowe i ustaw wartości delta Ct na >35, aby upewnić się, że w linii komórkowej królika VX2 występuje minimalne zanieczyszczenie myszy. Całkowita objętość każdej reakcji wynosiła 10 μl, składająca się z 5 μl 2x Mastermix, 1 μl starterów do przodu + do tyłu z końcowym stężeniem startera w reakcji przy 250 nM i 4 μl próbki DNA.
nuta: Ustala się wartości progowe, a wartości delta Ct ustala się na >35, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie myszy w linii komórkowej VX2 królika. Zalecany poziom DNA VX2 do wiarygodnego wykrywania za pomocą qPCR wynosi 1-10 pg.
2. Hodowla komórkowa VX2 i tworzenie zawiesiny komórkowej
- Rozmrozić fiolki zawierające komórki VX2 (zamrożone w kroku 1.2.7) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i przenieść komórki do stożkowej probówki wirówkowej z 10 ml pożywki hodowlanej (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS i 1% penicylina-streptomycyna). Wirować przez 8 minut przy 107 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki.
- Przenieść ponownie zawieszone komórki do dużej kolby hodowlanej. Inkubować komórki bez wstrząsania w temperaturze 37 °C. Codziennie sprawdzać komórki pod kątem zbieżności za pomocą mikroskopii świetlnej i zmieniać pożywkę hodowlaną co trzy dni.
- Tworzenie hodowlanej zawiesiny komórek VX2 do wstrzykiwań
- Trypsynizuj komórki, dodając 3 ml 0,25% trypsyny do kolby, gdy komórki osiągną 80% zbieżności. Umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C) na 5 minut. Przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej i wirować przez 8 minut przy 107 x g, a następnie usunąć supernatant.
- Przemyć granulki komórek 3 razy 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, odwirować i usunąć supernatant jak powyżej. Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem do stężenia 4 x 107 komórek/ml i umieścić w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej na lodzie.
- Tworzenie namnażonej in vivo zawiesiny komórek VX2 do wstrzykiwań
- Rozmrozić zamrożone bloki guza VX2 (1 cm x 1 cm), zmielić na płytce hodowlanej za pomocą ostrza skalpela i przecedzić przez filtr 70 μm, jak w kroku 1.1.1. Dodawaj sekwencyjnie niewielkie ilości HBSS, aby upewnić się, że wszystkie komórki są napięte do końcowej objętości 1 ml. Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem do stężenia 1 x107/ml i umieścić na lodzie w sterylnej probówce.
nuta: Bloki nowotworowe uzyskano od współpracownika laboratoryjnego z wcześniejszej propagacji guzów VX2 w mięśniach czworogłowych uda.
3. Ustanowienie modelu chirurgicznego
- Ustalenie znieczulenia chirurgicznego i przygotowanie przedoperacyjne
- Samice białych królików nowozelandzkich (2,5-3,5 kg) należy poddać premedykacji na 1 godzinę przed planowanym zabiegiem chirurgicznym za pomocą zastrzyków z acepromazyny (1 mg/kg domięśniowo) i meloksykamu (0,2 mg/kg mc. m.kw.). Samicę białego królika nowozelandzkiego (o wadze 2,5-3,5 kg) należy znieczulić 2-5% wziewnym izofluranem, usunąć sierść pokrywającą miejsce wstrzyknięcia i oczyścić miejsce wstrzyknięcia roztworem jodu powidonu.
- Zaintubuj znieczulone króliki za pomocą maski krtaniowej (LMA) i zabezpiecz taśmą, utrzymując głębokie znieczulenie, zwiększając wziewną dawkę izofluranu w zakresie 2-5%. Regularnie monitoruj znieczulenie chirurgiczne przez cały czas trwania zabiegu, sprawdzając parametry życiowe (częstość oddechów, napełnianie naczyń włosowatych, saturacja tlenem, jeśli jest dostępna) i monitorując objawy sugerujące ból (ruch, wycofanie się z bodźców, hałasy) lub lekkie znieczulenie (ruch, żucie rurki LMA).
nuta: Powinien to zrobić ktoś z doświadczeniem w monitorowaniu znieczulenia chirurgicznego.
- Umieść cewnik do żył usznych o rozmiarze 22 w brzeżnej żyle grzbietowej. Cefazolinę (20 mg/kg) podawać dożylnie 10 minut przed chirurgicznym nacięciem skóry.
- Przypnij włosy na miednicy i brzuchu przed umieszczeniem królika na stole operacyjnym, a następnie ułóż króliki w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym. Oczyść pole operacyjne za pomocą 3-etapowego chirurgicznego przygotowania skóry (mydło betadynowe, roztwór chlorheksydyny, roztwór betadyny). Ułóż pole operacyjne serwetami laparotomijnymi po wyznaczeniu górnej części kości łonowej, pozostawiając odsłonięty obszar dolnej części brzucha o wymiarach 5 cm x 5 cm.
- Wykonanie nacięcia po laparotomii i identyfikacja rogów macicy
- Załóż czepek chirurgiczny i maskę na twarz. Szoruj ręce za pomocą chlorheksydyny lub betadyny roztworu do peelingu chirurgicznego. Stosując sterylną technikę, załóż sterylny fartuch i sterylne rękawice chirurgiczne.
- Za pomocą skalpela z 11 ostrzami # wykonaj nacięcie o długości 2,5 cm 1 cm czaszki do spojenia łonowego przez skórę i tkankę podskórną brzucha królika. Naciąć powięź prostą i wyciąć mięśnie proste z boku, aby odsłonić leżącą pod spodem otrzewną. Wejdź ostro do otrzewnej po upewnieniu się, że spód jest wolny od jelit lub innych narządów jamy brzusznej.
- Zlokalizuj rogi macicy identyfikujące pęcherz moczowy i przesuwając palec w rękawiczce wyżej, z tyłu i z boku nad wierzchołkiem pęcherza.
nuta: W razie potrzeby pełny pęcherz można opróżnić za pomocą cyfrowego ciśnienia. Po zlokalizowaniu przeprowadź rogi macicy przez nacięcie brzucha, aby spoczęły na ścianie brzucha.
- Za pomocą plecionego szwu wchłanialnego 3-0 wykonaj pojedyncze podwiązanie szwów każdego rogu macicy około 1,5-2,0 cm dystalnie do szyjki macicy. Umieść szew tylko przyśrodkowo do tętnic macicznych, które biegną wzdłuż bocznej części każdego rogu. Zawiąż szwy ciasno, aby zamknąć dystalne rogi macicy (ryc. 1).
- Inokulacja mięśniówki VX2
- Za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknąć 0,5 ml wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek VX2 z etapu 2.3.2 (dla modelu VX2 z hodowlą) lub 2.4 (dla modelu VX2 rozmnażanego in vivo) do mięśniówki macicy każdego rogu macicy proksymalnie do miejsca szwu (między miejscem szwu a szyjką macicy). Wstrzykiwać przez 1 minutę i upewnić się, że komórki nie są wstrzykiwane do leżącej poniżej jamy macicy. Znieczulenie zwierząt za pomocą wziewnego izofluranu (2-5%) i urządzenia znieczulającego z obwodem Baina.
- Uciskaj miejsce wstrzyknięcia mięśniówki macicy przez 30 s po wstrzyknięciu, aby zminimalizować wyciek komórek. Sprawdź miejsca wstrzyknięcia i szwów pod kątem hemostazy i umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej.
- Zamykanie nacięcia chirurgicznego
- Głębokie zamknięcie ściany brzucha: Zidentyfikuj wierzchołek nacięcia otrzewnej i chwyć otrzewną, mięsień prosty i powięź za pomocą kleszczyków tkankowych.
- Aby to zrobić, zakotwiczyć szew na jednym wierzchołku nacięcia, zszywając powierzchownie do głębokości po jednej stronie nacięcia i głęboko do powierzchownie po drugiej. Zawiąż węzeł. Za pomocą dołączonego szwu wykonaj ściegi biegnące prostopadle do nacięcia przez warstwy ściany brzucha, pracując krok po kroku wzdłuż nacięcia z boku na bok. Zawiąż szew i wytnij.
- Powierzchowne zamknięcie ściany brzucha: Zidentyfikuj wierzchołek nacięcia skóry i zszyj skórę brzucha za pomocą zakopanego, biegnącego, podskórnego wchłanialnego szwu polifilamentowego 3-0. Nałóż klej chirurgiczny na zamknięte nacięcie, aby przeciwdziałać krawędziom skóry.
- Aby to zrobić, zakotwiczyć szew na jednym wierzchołku nacięcia, zszywając głęboko do powierzchownego po jednej stronie nacięcia i powierzchownie do głębokiego po drugiej. Zawiąż węzeł. Za pomocą dołączonych szwów wykonaj szwy biegnące w warstwie skórnej równolegle do nacięcia, pracując krok po kroku wzdłuż nacięcia z boku na bok. Zawiąż szew i wytnij.
- Opieka pooperacyjna
- Budzenie się ze znieczulenia: Wyłącz izofluran po zamknięciu nacięcia i pozwól królikowi oddychać tlenem przez maskę, jednocześnie monitorując oznaki przebudzenia (np. ruchy spontaniczne, ruchy otwierania oczu i żucia dróg oddechowych maski krtaniowej). Ekstubuj królika po zauważeniu tych objawów i dostarczaj tlen za pomocą maski i ciepłego koca, aż króliki będą czujne i będą w stanie samodzielnie siedzieć.
- Monitorowanie pooperacyjne: Monitoruj króliki dwa razy dziennie przez 4 dni i codziennie przez dodatkowe 10 dni po operacji. Aby monitorować, oceń ich ogólny stan, spożycie pokarmu i wody, wydalanie moczu i kału, ocenę bólu, wagę, parametry życiowe (tętno, częstość oddechów) oraz miejsce operacji w poszukiwaniu obrzęku, rumienia, wydzieliny lub rozejścia się.
- Kontrola bólu pooperacyjnego: Meloksykam należy podawać codziennie (0,2 mg/kg m.c.) przez 48 godzin po operacji, a następnie w razie potrzeby na podstawie oceny bólu. Buprenorfinę podawać bezpośrednio po operacji i co 12 godzin (0,01-0,05 mg/kg m.kw.) przez 24 godziny, a następnie w razie potrzeby na podstawie oceny bólu
- Antybiotyki (enrofloksacyna 5 mg/kg domięśniowo) mogą być podawane codziennie przez siedem dni po operacji, aby zapobiec zakażeniu rany, zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii. Podawać płyny podskórne (15 ml SQ) dwa razy dziennie w razie potrzeby w celu odwodnienia, a miękkie pokarmy lub inne suplementy diety są dostarczane codziennie, w zależności od potrzeb do utraty wagi.
