Modelowanie komunikacji raka jajnika do obrazowania analizy spektrometrii mas: metoda identyfikacji małocząsteczkowych komunikatorów chemicznych w rozwoju przerzutowego guza jajnika

Streszczenie

Źródło: Zink, K. E. et al. Przechwytywanie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowania spektrometrii mas. J. Vis. Exp. (2019)

Ten protokół opisuje technikę przygotowania próbki poprzez kokulturację eksplantatów jajników z komórkami raka jajowodu. Próbki te są wizualizowane za pomocą obrazowej spektroskopii mas lub IMS w celu wykrycia wymiany małych cząsteczek między komórkami i tkankami, co prowadzi do rozwoju guza.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Ustawianie i inkubacja zjeżdżalni poddanej ITO dla kokultur

1. Niepodzielne kokultury
   1. Upłynnić agarozę w temperaturze 70 °C na gorącym talerzu.
   2. Umieść 8-dołkową przegrodę na szkiełku nasączonym tlenkiem indu i cyny (ITO) (Rysunek 1A). Gumowy spód przegrody pomaga w przyleganiu do szkiełka, ale podczas galwanizacji agarozy należy stosować ciągły, delikatny nacisk w dół, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani mieszania między studzienkami.
   3. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odwirować (5 min przy 800 obr./min) i ponownie zawiesić do 50 tys. komórek na 150 μl w 1x pożywce DMEM. Jeśli optymalna jest inna gęstość komórek, upewnij się, że na tym etapie zawiesina komórek jest 2 razy większa od pożądanej gęstości końcowej (np. dla końcowego stężenia 50 000 komórek w 300 μl, gęstość komórek na tym etapie wynosi 50 000 komórek w 150 μl).
   4. Przed posiewem hodowli komórkowej dodaj eksplant jajnika do środka studzienki (ryc. 1B).
   5. Dodaj agarozę do każdej kultury komórkowej w osobnych probówkach o pojemności 2 ml tuż przed posiewem. Dla każdej studzienki połącz 200 μl zawiesiny komórek i 200 μl skroplonej agarozy w probówce o pojemności 2 ml. Na przykład w przypadku czterech studzienek połącz 800 μl zawiesiny komórek i 800 μl 2% agarozy. Część mieszaniny zostanie pozostawiona, ale zrobienie nieco więcej niż to konieczne pozwoli uniknąć pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
      1. Dodaj agarozę do poszczególnych kultur komórkowych bezpośrednio przed posiewem tej hodowli komórkowej. Agaroza ostygnie w mniej niż minutę, więc przygotuj się na szybkie talerzowanie.
   6. Natychmiast dodać 300 μl mieszaniny komórek i agarozy do każdej studzienki (ryc. 1C). Rycina 1C przedstawia trzy warunki komórkowe i jeden stan pożywki, z których każda jest posiana z jajnikiem lub bez niego.
   7. Szkiełko inkubacyjne w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w nawilżanym inkubatorze.
2. Podzielone kokultury
   1. Wytnij przegrody z cienkiego, gładkiego tworzywa sztucznego (Rysunek 2A).
      nuta: W tym eksperymencie wykorzystano boki sterylnego jednorazowego zbiornika na media, ponieważ są one płaskie i cienkie. Przytnij je na tyle szeroko, aby ściśle pasowały do przeciwprostokątnej studni (~13 mm).
   2. Upłynnić agarozę w temperaturze 70 °C na gorącym talerzu.
   3. Umieść 8-dołkową przegrodę na szkiełku poddanym działaniu ITO (Rysunek 2B). Gumowy spód przegrody pomaga w przyleganiu do szkiełka, ale podczas galwanizacji agarozy należy stosować ciągły, delikatny nacisk w dół, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani mieszania między studzienkami.

2. Suszenie szkiełka i przygotowanie do MALDI-TOF MS

1. Po czterech dniach (lub dowolnym preferowanym punkcie czasowym) wyjmij rozdzielacz komory z korków agarozowych i szkiełka (rysunek 1D). Delikatnie odczep boki agarozy od komory płaską szpatułką i delikatnie pociągnij komorę do góry, uważając, aby nie przesunąć żadnych zatyczek agarozowych. Jeśli się poruszają, delikatnie zmień ich położenie, aby się nie stykały.
2. Umieść szkiełko w piekarniku o temperaturze 37 °C na około 4 godziny, obracając o 90° co godzinę.
   nuta: Obrót szkiełka jest ważny, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie ciepła w całej próbce.
3. Po wyschnięciu wyjmij szkiełko z piekarnika (Rysunek 1E).
4. Nanieść roztwór matrycowy za pomocą rozpylacza (rysunek 1F), o następujących parametrach: temperatura = 30 °C, natężenie przepływu = 0,2 ml/min, liczba przejść = 8, kierunek = CC i odległość dysz = 40 mm.
   nuta: Zamiast rozpylacza matrycowego do nakładania płynnej matrycy można użyć aerografu artystycznego. Do natryskiwania można użyć tego samego roztworu matrycy, ale potrzeba około dwa razy więcej roztworu. Gdy szkiełko jest zaciśnięte tak, aby zwisało pionowo, spryskaj szkiełko pod kątem 90° w odległości około jednej stopy, aż warstwa matrycy będzie widoczna.
5. Dodać 1 μl kalibru (czerwień fosforowa dla tarcz <500 Da, mieszanina peptydów (patrz tabela materiałów) dla celów <5,000 Da), aby usunąć plamy na szkiełku. Czerwień fosforowa nie wymaga mieszania z matrycą, ale mieszanina peptydów wymaga mieszaniny 1:1 z matrycą, aby wspomóc jonizację. Poczekaj, aż kaliber wyschnie.
6. Narysuj X za pomocą markera permanentnego w każdym rogu slajdu i zrób zdjęcie optyczne za pomocą aparatu lub skanera w rozdzielczości 1,200 dpi.

Wyniki

Rysunek 1: Przebieg pracy w celu przygotowania próbki niepodzielonej kokultury. (A) Przyklej 8-dołkową komorę do przewodzącej strony szkiełka pokrytego ITO. (B) Umieść przepołowione jajniki w środku studni dla warunków kokultury. (C) Dodać 300 μl zawiesiny agarozy/komórek bezpośrednio do studzienek. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Denville	Zobacz materiał C1017-O	Aby zebrać komórki
Milipory	PEZGS0816	Ponownie wykorzystany z Millipore Millicell Prowadnica studzienkowa EZ-slide
Sigma-Aldrich	34998-4L	Rozpuszczalnik do natryskiwanej matrycy
Eppendorf	5810 R	Aby zebrać komórki i usunąć Supernatant
Bruker Daltonic	8201344	Matryca natryskiwana na wysuszone szkiełko
Bruker Daltonic	8201346	Matryca natryskiwana na wysuszone szkiełko
Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11995-065	Podłoże zmieszane z agarozą
Genesee Scientific	22-282	Dla podwielokrotności agarozy
Bruker	8237001	Platforma do inkubacji wspólnych kultur
Sigma-Aldrich	A9414-10G	Zmieszany z mediami do powlekania
Corning	Numer katalogowy: 4870	Służy do cięcia plastikowych przegród do Komory dzielone
Bruker Daltonic	8206195	Kaliberent do średniego zakresu mas
Sigma-Aldrich	343-242-5G	Kaliber do małego zakresu mas
Simga-Aldrich	E2758	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Peprotech Sp. z o.o.	100-15	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Komórka	30-005-CR	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Sigma-Aldrich	11074547001	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Gibco (firma Gibco)	25030-081	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Technologie Fisher	A116-50	Dodano do roztworu macierzy
Technologie HTX		Do nakładania matrycy

powiedział: powiedział: szt.