$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Synteza rdzenia Gold Nanostar
UWAGA: Złote nanogwiazdy są używane jako rdzenie dla obu wersji nanosond SERRS używanych w tym eksperymencie.
- Przygotować 800 ml 60 mM roztworu kwasu askorbinowego (C, 6, H, 8O6) w wodzie dejonizowanej (DI) i 8 ml 20 mM roztworu kwasu tetrachloroaurowego (HAuCl4) w wodzie DI. Schłodzić do 4 °C.
- Wykonać ten etap reakcji w temperaturze 4 °C. Umieścić kolbę stożkową zawierającą 800 ml roztworu kwasu askorbinowego na magnetycznej płytce mieszającej i wywołać stały wir. Szybko dodaj 8 ml roztworu kwasu tetrachloroaurowego do wiru. W ciągu kilku sekund uformują się nanogwiazdy, a roztwór przyjmie ciemnoniebieski kolor. Jeśli kolor w dowolnym momencie stanie się różowy lub fioletowy, co oznacza tworzenie się nanosfer, zawiesinę należy odrzucić i ponowić próbę syntezy.
- Wlać zawiesinę nanostar do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przez 20 minut (4 °C, 3,220 x g). Odessać supernatant, pozostawiając około 200 μl roztworu w każdej probówce. Zachowaj ostrożność, aby nie naruszyć osadu nanocząstek na dnie tuby.
nuta: Supernatant powinien mieć niebieski odcień ze względu na pozostałe zawieszone nanogwiazdy.
- Za pomocą mikropipety wymieszać roztwór, aby zawiesić i zebrać nanocząstki z każdej probówki. Część granulki może zostać zagęszczona na dnie probówki i nie ulega ponownemu zawieszeniu nawet przy energicznym pipetowaniu – należy wyrzucić tę część.
- Przenieś zawiesinę nanocząstek do kasety dializacyjnej (MWCO 3,5 kDa) i dializuj przez co najmniej trzy dni w 2 litrach wody demineralizowanej, zmieniając wodę codziennie. Przechowuj nanogwiazdy w dializie w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca z podmianą wody co 3-4 dni.
nuta: Nanogwiazdy powinny być poddawane dializie do czasu, gdy będzie to konieczne do przeprowadzenia reakcji krzemionkowania, jak opisano w sekcji 2.
2. Formowanie się powłoki krzemionkowej
UWAGA: Syntetyzowane są dwa rodzaje nanosond Ramana. Procedura syntezy jest taka sama dla obu, a jedyną różnicą jest zastosowana cząsteczka reporterowa Ramana (barwnik). W tym eksperymencie użyto nadchloranu IR780 i IR140. Reakcja powinna być zawsze przeprowadzana w plastikowych pojemnikach. Synteza jest wysoce skalowalna i może być dostosowana do pożądanej wymaganej ilości iniekcji. W tym miejscu opisano syntezę średnio seryjną, którą można skalować liniowo do mniejszych lub większych objętości w zależności od potrzeb, przy tych samych stężeniach i czasach reakcji. Reakcje dla dwóch typów nanosond SERRS mogą być przeprowadzane równolegle. Zwróć uwagę, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Sonikację należy przeprowadzić w celu redyspersji granulek nanocząstek po odwirowaniu podczas etapów mycia lub po przechowywaniu nanocząstek przez okres dłuższy niż jedna godzina. Sonikację należy przeprowadzać do momentu, gdy nanocząstki zostaną wyraźnie zawieszone w roztworze, zwykle przez 1 s.
- W probówce A (stożkowa probówka o pojemności 50 ml) wymieszaj 10 ml izopropanolu, 500 μl TEOS, 200 μl wody DI i 60 μl barwnika (nadchloran IR780 lub IR140, 20 mM w DMF (dimetyloformamid)).
- W probówce B (stożkowa probówka o pojemności 15 ml) wymieszaj 3 ml etanolu i 200 μl wodorotlenku amonu. Sonikuj nanogwiazdy z kroku 1.4, aby rozproszyć wszelkie klastry w roztworze i dodaj 1,2 ml nanogwiazd do probówki.
UWAGA: roztwór wodorotlenku amonu jest bardzo lotny i trudny do dokładnego pipetowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie potrzebny, aby ułatwić pipetowanie.
- Umieść rurkę A na mieszadle wirowym i wywołaj stały wir. Szybko dodaj zawartość probówki B do wiru i mieszaj przez około 5 sekund. Natychmiast przenieść do wytrząsarki i pozostawić ją do reakcji przez 15 minut, wytrząsając z prędkością 300 obr./min, w temperaturze pokojowej.
- Po 15 minutowej inkubacji wygasić reakcję, dodając etanol w celu napełnienia probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 20 minut w temperaturze 3 220 x g i temperaturze 4 °C.
- Odessać supernatant, pozostawiając około 0,5 ml roztworu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodać 1 ml etanolu i wymieszać pipetą, aby ponownie zawiesić nanocząstki. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przemyć 4 razy etanolem, wirując przy 11 000 x g przez 4 minuty, zasysając supernatant i ponownie zawieszając osad za pomocą ultradźwięków przez około 1 s.
- UWAGA: Na tym etapie krzemionkowe nanocząstki mogą być funkcjonalizowane, jak opisano w sekcji 3, lub ponownie zawieszone w wodzie DI z dodatkowym etapem mycia, w celu przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
3. Funkcjonalizacja powierzchni
UWAGA: Nanosondy IR780 SERRS będą sprzężone z przeciwciałami skierowanymi przeciwko receptorowi kwasu foliowego za pomocą środka sieciującego PEG, tworząc αFR-NPs; Nanosondy sterujące IR140 SERRS będą sprzężone z pasywującą monowarstwą PEG dla nt-NPs. Oba aromaty powstają w wyniku reakcji tiol-maleimid w oddzielnych, ale równoległych reakcjach.
- Przepłukać nanocząstki dwukrotnie, wirując przy 11 000 x g przez 4 minuty, odsysając supernatant i ponownie zawieszając osad w 1 ml etanolu za pomocą ultradźwięków. Powtórz etap prania jeszcze raz, ale ponownie rozpuść się w 1 ml 85% etanolu, 10% 3-MPTMS (3-merkaptopropylotrimetoksysilanu) i 5% wody DI. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny w celu wprowadzenia tioli na powierzchnię cząstek.
- Przemyć nanocząstki funkcjonalizowane tiolem przez odwirowanie przy 11 000 x g przez 4 minuty, zasysanie supernatantu i ponowne zawieszenie osadu za pomocą ultradźwięków, dwa razy w etanolu, dwa razy w DI, a na koniec w buforze HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) (10 mM, pH 7,1) i odstawić.
- UWAGA: Należy stosować bufor MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy) lub HEPES. o wyższym zasoleniu, takie jak PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), mogą indukować agregację nanocząstek.
- W przypadku funkcjonalizowanych przeciwciałami αFR-NPs, należy zareagować 200 μg przeciwciał (klon przeciwciała wiążącego białko antyfolianów [LK26]) z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym środka sieciującego PEG (poli(glikol etylenowy)(N-hydroksysukcynimid 5-pentanian) N′-(3-maleimidopropionylo)aminoetan (CAS: 851040-94-3), w dimetylosulfotlenku (DMSO)) w 500 μl buforu MES (10 mM, pH 7,1) przez 30 min.
- Usunąć nadmiar środka sieciującego i skoncentrować przeciwciało poprzez odwirowanie roztworu przeciwciało-PEG w filtrze odśrodkowym (MWCO 100 kDa). W przypadku filtrów odśrodkowych stosowanych w tym badaniu należy przeprowadzić wirowanie przez 10 minut w temperaturze 14 000 x g i temperaturze 23 °C. Odzyskać sprzężone przeciwciała w świeżej probówce, odwracając filtr i odwirowując przy 1 000 x g przez 2 minuty.
- Odpipetować nanocząstki IR780 z kroku 3.2 do probówki z przeciwciałami i zamieszać pipetą, aby wymieszać. Inkubować mieszaninę przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc w celu wytworzenia αFR-NPs.
- Aby utworzyć nt-NPs, dodaj 1% m/v metoksy-zakończony (m)PEG5000-maleimidem (CAS: 99126-64-4) rozpuszczony w DMSO do nanocząstek IR140 SERRS z kroku 3.2 i pozwól im reagować w 500 μl buforze MES (10 mM, pH 7,1) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.
- W przypadku podawania myszom (sekcja 4) należy odwirować oba aromaty nanosondy przy 11 000 x g przez 4 minuty, odessać supernatant w celu usunięcia roztworu z wolnymi nieprzereagowanymi przeciwciałami/PEG i ponownie rozproszyć każdy smak w buforze MES (10 mM, pH 7,1) w stężeniach 600 pM. Podczas ponownego zawieszania nanocząstek należy zminimalizować niepotrzebną ekspozycję na ultradźwięki, aby zapobiec denaturacji przeciwciała.
4. Wstrzykiwanie i obrazowanie nanosondy
- Przygotować nanosondy (αFR-NPs i nt-NPs) zgodnie z opisem w sekcjach 1-3 i wymieszać w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie 300 pM każdego typu w buforze MES (10 mM, pH 7,1). Opcjonalnie należy przygotować wzorce referencyjne 30 pM każdego z aromatów nanosondy w małych (100 μL) stożkowych probówkach.
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 1 ml zawiesiny nanocząsteczek każdej myszy i delikatnie masować brzuch, aby rozprowadzić nanocząsteczki w jamie otrzewnej. Umieść mysz z powrotem w obudowie. Po 25 lub więcej minutach poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 .
- Przymocuj mysz na platformie operacyjnej, w pozycji leżącej na plecach (w przypadku obrazowania całego brzucha platforma musi być montowana na pionowym stoliku mikroskopu).
- Za pomocą ząbkowanych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń skórę, aby odsłonić otrzewną i wykonaj duże nacięcie strzałkowe (o długości od 2 do 3 cm), aby odsłonić cały brzuch. Przymocuj płaty otrzewnowe do platformy. Umyj wnętrze jamy otrzewnej co najmniej 60 ml PBS za pomocą plastikowej butelki ze spryskiwaczem.
UWAGA: Aby umożliwić niezakłócone obrazowanie całego brzucha, jelita muszą zostać zmobilizowane lub wycięte. W celu wycięcia należy wykonać wycięcie z podwiązaniem naczyń krezkowych w celu zmniejszenia krwotoku do jamy brzusznej.
- Alternatywnie, aby zobrazować określone narządy, wyciąć je po umyciu PBS i umieścić na szkiełku mikroskopowym.
- Przenieś platformę lub szkiełko do mikrospektrofotometru Ramana z pionową konfiguracją optyczną i zmotoryzowanym stolikiem do obrazowania; użyj komercyjnego systemu z laserem diodowym o mocy 300 mW i długości fali 785 nm, z siatką 1200 rowków na mm, wyśrodkowaną na 1 115 cm-1.
- Skoncentruj się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki światła białego, parafokalnej z laserem Ramana. Wybierz obszar, który ma być obrazowany, i żądaną rozdzielczość; W tym raporcie zastosowano tryb szybkiej akwizycji (widma uzyskane przy ciągłym oświetleniu laserowym przy stale poruszającym się stoliku mikroskopu, z efektywną rozdzielczością przestrzenną 14,2 μm na 200 μm; przy 5-krotnym powiększeniu, mocy 100 mW przy obiektywie i <100 ms ekspozycji na punkt).
nuta: W razie potrzeby probówki z nanosondami referencyjnymi z kroku 4.1 można umieścić w obrazowanym obszarze, aby zapewnić wewnętrzne wzorce referencyjne do późniejszej analizy. Upewnij się, że żadne zewnętrzne źródła światła inne niż laser nie docierają do celu.
- Opcjonalnie przygotować próbkę do przetwarzania histologicznego i walidacji przez utrwalenie w 4% paraformaldehydzie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać PBS w temperaturze 4 °C przez 15 minut co najmniej dwa razy. Przechowywać próbkę w 70% etanolu w wodzie do czasu standardowego przetwarzania histologicznego i zatopienia parafiny. W celu walidacji histologicznej guzów, skrawki (o grubości 5 μm) z różnych głębokości bloku parafinowego można wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E).