System hodowli proksymalnej: technika hodowli in vitro do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

A. Przygotowanie komórek

1. Izolacja i hodowla ludzkich pierwotnych komórek międzybłonka
   1. Wyizolować ludzkie pierwotne komórki międzybłonka (HPMC) z ludzkiej sieci i wyhodować je w kompletnym pożywce wzrostowej [zmodyfikowana pożywka Dulbecco Eagle's Substrate (DMEM) zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% aminokwasów endogennych i 1% witamin] w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
      nuta: HPMC są zwykle uprawiane do 100% konfluencji (rysunek 1A).
2. Warunki wzrostu komórek raka jajnika
   1. Hoduj komórki raka jajnika HeyA8 w kompletnym pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
      nuta: Użyj komórek HeyA8 wyhodowanych do około 80% konfluencji (ryc. 1B).

B. Hodowla komórkowa

1. Konfiguracja posiewu proksymalnego
   1. Używaj wkładek Transwell do płytek 6-dołkowych z membraną poliwęglanową o grubości 10 μm poddanej działaniu kultur tkankowych z porami 0,4 μm (10⁸ porów/cm²) i obszarem wzrostu 4,67^cm2. W razie potrzeby zoptymalizuj pod kątem różnych rozmiarów wkładek, skalując liczbę komórek zasianych zgodnie z powierzchnią wzrostu. Przed użyciem podgrzać kompletną pożywkę wzrostową, trypsynę i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C.
2. Przygotowanie wkładek
   1. Aby wysiać komórki HeyA8 na dolnej powierzchni membrany wkładki, wyjmij wkładkę z opakowania za pomocą sterylnych kleszczy i umieść ją odwróconą w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm.
   2. Użyj naczynia o średnicy 15 cm, ponieważ ma ono głębokość, aby pomieścić odwróconą wkładkę, lub zastąp je dowolnym odpowiednim sterylnym pojemnikiem. W zależności od eksperymentu umieść wymaganą liczbę wkładek w naczyniu o średnicy 15 cm.
   3. Oznaczyć odpowiednio trzy kontrole i trzy warunki eksperymentalne markerem na krawędzi wkładek.
3. Przygotowanie komórek rakowych
   1. Aby trypsynizować komórki HeyA8 hodowane przy 80% zbiegu w kolbie o średnicy 25 cm² (~ 2 x 10⁶ komórek), dodaj 1 ml trypsyny (0,25%) przez 40–60 s i zneutralizuj trypsynę 6 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
   2. Odwirować komórki w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Policz żywe komórki za pomocą metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego.
4. Siew komórek rakowych
   1. Zawieś 100 000 komórek/ml żywych komórek HeyA8 w kompletnej pożywce wzrostowej. Ostrożnie wysiewaj 80 000 komórek HeyA8 zawieszonych w 800 μl kompletnego podłoża wzrostowego na dnie wkładki (która jest teraz skierowana do góry, ponieważ jest odwrócona).
   2. Zasiej komórki, aby utworzyły kształt przypominający kopułę, tak aby komórki pozostały na wkładce (Rysunek 1C). Zacznij od środka membrany i powoli przesuwaj się na zewnątrz koncentrycznymi okręgami, powoli pipetując. Unikaj oddalania się od krawędzi na więcej niż 3 mm, aby zapobiec rozlaniu się medium.
      nuta: Liczba wysianych komórek będzie zależeć od tempa wzrostu komórek i czasu trwania eksperymentu. Liczba komórek HeyA8 wysianych do tej bliższej hodowli została zoptymalizowana, a komórki będą zlewać się w 80-90% pod koniec trzeciego dnia.
5. Przyłączanie komórek rakowych
   1. Przykryj 15-centymetrową naczynie i ostrożnie przenieś naczynie zawierające wkładki do inkubatora CO₂ . Bardzo ważne jest, aby na tym etapie nie zakłócać spadku podłoża i komórek na wkładce. Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C na 4 godziny, aby umożliwić komórkom rakowym przyczepienie się do wkładki.
6. Przygotowanie komórek międzybłonka
   1. Po około 4 godzinach trypsynizuj HPMC wyhodowane przy 100% zbiegu w kolbie o średnicy 75 cm² (~ 4 x 10⁶ komórek) z 2 ml trypsyny (0,25%) przez 1-2 minuty i zneutralizuj trypsynę 12 ml kompletnej pożywki wzrostowej.
   2. Odwirować komórki przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i policzyć żywe komórki przy użyciu metody wykluczania barwnika trypanowego niebieskiego.
7. Sadzenie komórek międzybłonka
   1. Zawiesić 300 000 komórek/ml żywych HPMC w kompletnej pożywce wzrostowej. Dodaj 2,5 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Ostrożnie wynieś 15-centymetrową naczynie z wkładkami do okapu bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć wkładkę i umieść ją w dołku płytki 6-dołkowej tak, aby była pionowa, z komórkami HeyA8 przymocowanymi do dolnej powierzchni zanurzonymi w kompletnej pożywce wzrostowej (ryc. 1C).
   2. Wysiewaj 450 000 HPMC zawieszonych w 1,5 ml pożywki wzrostowej we wnętrzu wkładek z komórkami HeyA8 przymocowanymi do powierzchni skierowanej do dna studzienki (ryc. 1C) lub do wkładek bez żadnych komórek HeyA8 dla kontroli HPMC. Dodać 1,5 ml pożywki wzrostowej bez komórek do kontrolek HeyA8.
8. Rozwój kultury proksymalnej
   1. Pozwól kulturze proksymalnej rosnąć w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 72 godziny. W razie potrzeby podłoże można uzupełnić w następujący sposób.
      1. Do wnętrza wkładki należy usunąć 750 μl i dodać 750 μl świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
      2. Z zewnętrznej strony wkładki (płytki 6-dołkowej) należy pobrać 1 ml i dodać 1 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. 1 ml został wybrany ze względu na wygodę wymiany podłoża w jednym kroku. W razie potrzeby 1,25 ml można wyjąć i wymienić.

Rysunek 1: Montaż systemu hodowli proksymalnej.(A) Ten panel przedstawia ludzkie pierwotne komórki międzybłonka (HPMC). (B) Ten panel pokazuje komórki raka jajnika HeyA8. Podziałka = 200 μm (A-B). (C) Komórki HeyA8 wysiano na dolnej powierzchni wkładki transwell z porami 0,4 μm. Po przyłączeniu komórek wkładkę umieszczono w studzience z 6-dołkową płytką zawierającą pożywkę wzrostową. Komórki międzybłonka zostały następnie wysiane we wkładce tak, aby przyczepiły się do górnej powierzchni i zostały oddzielone od komórek HeyA8 przez błonę. Pory 0,4 μm w błonie umożliwiały wymianę wydzielanych czynników, ale hamowały bezpośredni kontakt między komórkami.