Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

Streszczenie

Źródło: Peters, P. N. et al. Modelowanie wczesnych etapów rozprzestrzeniania się raka jajnika w organotypowej hodowli ludzkiej jamy otrzewnej. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Protokół

1. Posiewanie kultur organotypowych

1. Uwolnić NOF (normalne fibroblasty omentalne) z kolby hodowlanej o średnicy 75^cm2 przez płukanie 10 ml PBS, a następnie 3 ml 0,25% trypsyny/25 mM EDTA przez nie więcej niż 5 minut. Zneutralizować trypsynę co najmniej 3-krotnością objętości pożywki o pełnym wzroście.
2. Przenieś trypsynizowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj w tempie 0,5 g x 3 min. Usuń supernatant i przenieś komórki z powrotem do 5 ml pełnej pożywki wzrostowej. Użyć licznika komórek, aby policzyć komórki odzyskane z kolby hodowlanej.
3. Rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości pożywki o pełnym wzroście do płytki 2 000-4 000 NOF na 100 μl na czarnej, klarownej, 96-dołkowej płytce. Dodać 0,5 μg/100 μl kolagenu I ze szczurzego ogona do mieszaniny komórek przed posiewem. Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ w wilgotnym środowisku przez co najmniej 4 godziny lub do momentu, gdy komórki przylegają do powierzchni płytki.
4. Uwolnić HPMC (pierwotne ludzkie komórki międzybłonka) z kolby hodowlanej, stosując te same metody, które opisano w krokach 1.1 i 1.2. Rozcieńczyć komórki w odpowiedniej ilości pełnej pożywki wzrostowej na płytce 10 000-20 000 HPMC na 50 μl na wierzchu NOF już posiaznanego kolagenem I na płytkach 96-dołkowych. Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w wilgotnym środowisku przez co najmniej 18 godzin przed rozpoczęciem eksperymentów.
5. Hodowla komórek raka jajnika HeyA8 z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) w pożywce o pełnym wzroście. Komórki raka jajnika HeyA8 są znakowane fluorescencyjnie przez ekspresję wektora lentiwirusowego wyrażającego widłonóg cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Komórki raka jajnika HeyA8 powinny być zlewane w 80-90% w dniu stosowania (logarytmiczna faza wzrostu). Uwolnić komórki z płytki hodowlanej i policzyć przy użyciu tych samych metod, które opisano w krokach 1.1-1.2 dla komórek pierwotnych.
6. Pozwól komórkom raka jajnika zregenerować się w pożywce o pełnym wzroście przez 15-20 minut w temperaturze 37°C w stożkowej probówce z luźno zamkniętą pokrywką.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pbs	Fisher Naukowy	SH3001304
Naczynia hodowlane 15 cm	BD Nauki biologiczne	353025
DMEM z L-Glutaminą	Corning	10-013-CV
Witaminy MEM	Corning	25-020-CL
MEM Aminokwasy endogenne	Corning	25-025-CI
Penicylina-Streptomycyna	Corning	30-002-CI
Shakerze bostońskim	Rybak termiczny	MaxQ 4450
wirówka	Eppendorf	5702
inkubator	Rybak termiczny	Forma Series II z płaszczem wodnym Inkubator CO2 model 3100
Trypsyna EDTA, 1x (0,25%)	Corning	25-053-CI
Kolby T-75	BD Nauki biologiczne	353136
Kolby T-175	BD Nauki biologiczne	353112
Końcówki do pipet	Rainin	P2, P10, P20, P200 oraz P1000
Końcówki do pipet	Corning	Końcówki z filtrem P2, P10, P20, P200 oraz P1000
Licznik komórek	Invitrogen	hrabina
Komora do liczenia komórek hrabiny Slajdów	Invitrogen	Zobacz materiał C10313
Niebieska plama trypanowa (0,4%)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15250-061
Kolagen typu I (ogon szczura)	BD Nauki biologiczne	354236
Płytka 96-dołkowa, przezroczyste dno,	BD Nauki biologiczne	353219

powiedział: szt.