Izolacja komórek międzybłonkowych: technika izolowania pierwotnych komórek międzybłonka z próbki ludzkiej tkanki sieci

Abstract

Źródło: Peters, P. N. et al. Modelowanie wczesnych etapów rozprzestrzeniania się raka jajnika w organotypowej hodowli ludzkiej jamy otrzewnej. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film opisuje protokół izolacji pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka od próbki ludzkiej sieci komórkowej. Komórki międzybłonka można wykorzystać do stworzenia modelu raka jajnika in vitro w celu zbadania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych nieprzekształconych komórek zrębu

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek ludzkich.
   1. Pobrać próbki ludzkiej sieci o długości 2 cm³ usunięte podczas operacji jamy brzusznej i natychmiast zanurzyć tkankę w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami RT (PBS) (ryc. 1A). Kawałek sieci o wymiarach 3 cm x 2 cm zwykle daje 1 milion pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka (HPMC) i 200 000 pierwotnych ludzkich fibroblastów lub normalnych fibroblastów ocznych (NOF).
   2. Odwiruj PBS, w którym zanurzono tkankę, w 0,5 x g przez 3 minuty, tak szybko, jak to możliwe po pobraniu (< 2 godziny w PBS) i przenieś tkankę do świeżej 20 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Pokrój tkankę na kawałki o wielkości 5 mm3, mieląc je skalpelami w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm (ryc. 1B).
2. Pierwotna izolacja ludzkich komórek międzybłonka
   1. Aby wyizolować HPMC, przenieś zmieloną tkankę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odczekaj 1 minutę, aż stałe kawałki wypłyną na wierzch (Rysunek 1C i D). HPMC i czerwone krwinki (RBC) będą obecne w cieczy na dnie. Za pomocą pipety usuń płyn z dna probówki i do nowej stożkowej probówki. Odwirować ciecz o masie 0,5 x g przez 3 minuty i odessać supernatant z osadu HPMC/RBC.
      1. Powtórz proces trzy razy: dodać 20 ml PBS do zmielonej tkanki, pozostawić tkankę do wyrośnięcia, usunąć płyn z dna za pomocą pipety i do probówki HPMC/RBC, odwirować i usunąć supernatant. Po zakończeniu wszystkich wirowań i odessaniu supernatantu, osad będzie zawierał HPMC i RBC.
   2. Umieścić wszystkie komórki z osadu w kolbie o średnicy 75^cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej (DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 1% witaminami MEM [93 mg/L], 1% aminokwasami endogennymi MEM [81,4 mg/L], 1% penicyliny streptomycyny [Pen-Strep, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny]).
   3. Wykonaj wtórne płukanie PBS w celu wyizolowania dodatkowych HPMC.
      1. W przypadku wtórnego płukania PBS należy wstrząsnąć pozostałą tkanką stałą z prędkością 200 obr./min, w temperaturze 37 °C przez 10 minut w 20 ml PBS, a następnie odczekać 1 minutę, aż chusteczka wypłynie na wierzch. Usunąć płyn z dna probówki do nowej probówki, odwirować przy 0,5 x g przez 3 minuty i odessać supernatant.
      2. Umieścić wszystkie HPMC/RBC z wtórnego PBS w oddzielnej kolbie o długości 75^cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej.
   4. Aby wyizolować pozostałości HPMC, wstrząsnąć zmieloną tkanką z prędkością 200 obr./min, 37 °C stopni przez 10 minut w 20 ml roztworu 1:1 0,25% trypsyny 25 mM EDTA:PBS objętościowo. Pozwól chusteczce urosnąć, zbierz płyn z dna probówki do nowej probówki o pojemności 50 ml i wiruj z prędkością 0,5 x g przez 3 minuty.
      1. Odessać supernatant i umieścić wszystkie HPMC/RBC w oddzielnej kolbie o długości 75^cm2 w 15 ml pełnej pożywki wzrostowej.
   5. Hodować posiane komórki w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w wilgotnym środowisku. Nakarm posiane komórki, dodając 15 ml pełnej pożywki wzrostowej w 3 i 5 dniu bez usuwania zużytej pożywki. HPMC można hodować przez 5-7 dni przed podziałem.
      1. Używaj HPMC o niskim pasażu (do pasażu 2) we wszystkich eksperymentach, aby zminimalizować dedyferencjację i modyfikację oryginalnego fenotypu. Użyj mikroskopu szerokokątnego, najlepiej z obiektywem 20x z możliwością kontrastu różnicowego z tworzywa sztucznego lub obiektywu 4-20x z możliwością kontrastu fazowego (filtry kontrastu fazowego pod mikroskopem) do wykonywania wszystkich obrazów komórek, oraz obiektywu 10x () w jasnym polu do analizy immunohistochemicznego barwienia 3,3'-diaminobenzydyny (DAB).
   6. Potwierdź, że HPMC są prostopadłościenne i wyrażają cytokeratynę 8 i wimentynę, wykonując immunohistochemię (Figura 2A, C, E).

Results

Rysunek 1. Izolacja pierwotnych ludzkich komórek omentalnych. (A) Fragment sieci jest pobierany podczas operacji w PBS i transportowany do laboratorium. Tkankę granuluje się w odległości 0,5 x g x 3 min i przenosi do świeżego PBS. (B) Kawałek sieci przenosi się na 10-centymetrową szalkę Petriego, myje PBS, a następnie używa ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Fisher Naukowy	SH3001304
Żyletki jednosieczne	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-640
Naczynia hodowlane 15 cm	BD Nauki biologiczne	353025
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Technologie życiowe	16000044_3616914956
DMEM z L-Glutaminą	Corning	10-013-CV
Witaminy MEM	Corning	25-020-CL
MEM Aminokwasy endogenne	Corning	25-025-CI
Penicylina-Streptomycyna	Corning	30-002-CI
Shakerze bostońskim	Rybak termiczny	MaxQ 4450
wirówka	Eppendorf	5702
inkubator	Rybak termiczny	Inkubator CO2 z płaszczem wodnym Forma Series II model 3100
Kolby T-75	BD Nauki biologiczne	353136
Kolby T-175	BD Nauki biologiczne	353112
Końcówki do pipet	Rainin	P2, P10, P20, P200 oraz P1000
mikroskop	Zeiss	Aksjowert 200m
Przeciwciało antyintegrynowe αVβ3, klon LM609	EMD Milipore	MAB1976
Wersja beta 1	Onkosynergia	System operacyjny 2966
Alfa 5 [CD49e]	ID Pharmingen	555615
Wersja beta 4 [CD104]	EMD Milipore	Rok macierzysty 2058
Końcówki do pipet	Corning	Końcówki z filtrem P2, P10, P20, P200 i P1000
Kolba szklana