Modelowanie kolonizacji komórek raka jajnika sieci komórkowej: metoda ex vivo do ustalenia kolonizacji plamki mlecznej znakowanych fluorescencyjnie komórek raka jajnika w mysich eksplantatach sieci

Streszczenie

Źródło: Krishnan, V. et al. Podejścia in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej plamki w tkance tłuszczowej otrzewnej. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie tworzymy ex vivo hodowlę narządów omentalnych pokrytą komórkami raka jajnika wykazującymi ekspresję GFP, aby zbadać kolonizację raka jajnika w obrębie eksplantatu jajnika. Protokół ten analizuje struktury komórek odpornościowych w sieci znane jako mleczne plamki, które sprzyjają przerzutom.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Kolonizacja mlecznej plamki ex vivo

1. Ustalenie podstawowych warunków hodowli narządów ex vivo
   1. Umieścić każdą sieć w pojedynczej wkładce płytki hodowlanej i umieścić w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 500 μl pożywki DME/F12 zawierającej 20% FCS. Hodowle narządów należy utrzymywać w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO₂ przez 24 do 48 godzin i/lub dodatkowe punkty czasowe. Należy użyć trzech niezależnych omentów (potrójnych próbek) dla każdego warunku (np. rodzaju podłoża/punktu czasowego).
   2. Aby potwierdzić integralność tkanek w doświadczalnych punktach końcowych, należy utrwalić i przetworzyć próbki zgodnie z opisem w kroku 1.1.3. Liczenie zdrowych i martwiczych adipocytów na skrawkach H&E może ocenić integralność tkanek. Wymagane jest co najmniej ~120 komórek z pięciu próbek biologicznych, aby określić procent obecnych żywych tkanek.
   3. Aby zmierzyć funkcję tkanki, umieść omenta (n = 3) w oddzielnych studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej 500 μl pożywki DME/F12 z 20% FCS. Pozostawić omenta do kondycjonowania pożywki w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO_{2 przez} 24 godziny, a następnie usunąć 250 μl do użycia w teście IL-6 ELISA.
2. Wspólna hodowla ex vivo sieci myszy z komórkami SKOV3ip.1-GFP
   1. Hodować i przygotowywać fluorescencyjnie znakowane komórki, pipetując^{1x10 6} rozmrożonych komórek w 10 ml pożywki w kolbie T-75. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO_{2 ,} aż osiągną 70% konfluencji. Trypsynizować i ponownie zawiesić w stężeniu 2 x 10⁶ komórek na ml.
   2. Nałóż ~6 μl kleju tkankowego na membranę wkładki hodowlanej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umyj membranę dwukrotnie sterylną wodą, aby usunąć nadmiar kleju. Wysuszyć membrany na powietrzu pod kapturem laminarnym.
   3. Ostrożnie wytnij omentę i przymocuj ją do membrany pokrytej klejem za pomocą sterylnych kleszczyków. Pozwól tkance przylegać do membrany przez 1 minutę przed dodaniem pożywki. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej na wierzch każdej sieci w każdej wkładce hodowlanej. Wypełnić obszar wokół komory transwell 2,5 ml DME/F-12 .
   4. Inkubować omentę z zawiesiną komórkową przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO_{2 .} Ostrożnie wyjmij i umyj omentę ~10 ml PBS. Wizualizacja ognisk fluorescencyjnych komórek rakowych za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania fluorescencyjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia do preparowania	Narzędzia naukowe	nie
Geimsa powiedział:	Fluka/Sigma Aldrich	Numer katalogowy: 48900
5% formaliny	Sigma	HT501320
DMEM (DMEM)	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	21-040-CV	Bez wapnia i magnezu
Kolagenaza	Worthington	LS004196
Wkładka do płytki hodowlanej Millicell	Milipory	PICM01250
Komórka-Tak	Corning	Numer telefonu 354240