Uzyskiwanie komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych: metoda hodowli komórek nabłonkowego raka jajnika z próbek guza jajnika

Streszczenie

Źródło: Pribyl, L. J. et al. Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek stałych. J. Vis. Exp. (2014)

W tym filmie opisujemy metodę izolowania i charakteryzowania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek tkanek guza jajnika litego. Nabłonkowe komórki raka uzyskane za pomocą tego protokołu są odpowiednie do zrozumienia procesów, które mogą prowadzić do inicjacji i rozwoju raka jajnika.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przetwarzanie tkanek

1. Pracując w sterylnych warunkach, przenieść próbki na szalkę Petriego (60 mm x 60 mm) zawierającą 10 ml świeżego, lodowatego PBS i za pomocą sterylnej żyletki pociąć na najmniejsze możliwe kawałki (2 mm lub mniej) (rysunki 1A i 1B).
2. Przenieść rozdrobnione tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml podgrzanej (37 °C przez 30 min) dypazy II (2,4 U/ml) w DMEM i inkubować w temperaturze 5% CO₂ i 37 °C przez 30 min. Aby zapewnić optymalne trawienie próbek, należy ręcznie mieszać zawiesinę komórkową co 5 minut.
3. Po 30 minutach inkubacji przenieść (za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml) zawiesinę komórek na sitko do komórek (oczko 70 μm) umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie docisnąć siatkę za pomocą tłoka strzykawki. Odrzucić wszelką niezdysocjowaną tkankę (pozostałą na wierzchu siatki) i zebrać otrzymaną zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 320 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 2).
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml DMEM zawierającym 10% FBS.
5. Zawiesinę komórkową inkubować na płytce Petriego w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C (ryc. 3).
6. Zmienić podłoże po 24 godzinach od pierwszego poszycia. Pozwala to na usunięcie resztek komórkowych i większości erytrocytów obecnych w hodowli.
7. Zmieniaj pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym kultury pierwotnego EOC są gotowe do dalszych zastosowań.

Wyniki

Rysunek 1. Przetwarzanie próbek klinicznych. A) Próbka stała przeniesiona na szalkę Petriego zawierającą 10 ml świeżej, lodowatej próbki 1x PBS. B) Próbki kliniczne dalej pocięte na kawałki o wielkości około 2 mm

Rysunek 2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x PBS, sterylne	Invitrogen	Nr kat. 14190-144
Pokrywka zakręcana, próbka polipropylenu pojemnik sterylny	Thermo Scientific
Pożywka DMEM, sterylna	Invitrogen	Numer katalogowy 11995-065
Surowica bydlęca płodowa, sterylna	Termo Naukowy Hyclon	SH30396.03
100x Penicylina-streptomycyna, płyn	Invitrogen	Rozdział 15140-122
Dypaza II, sterylna	Roche	Numer telefonu 04942 078 001
Małe kleszczyki i skalpel z cienką końcówką ostrze, sterylne	Fisher Naukowy	kleszcze: 08-953E, ostrza: 08-927-5D
Nożyczki do preparowania, małe, sterylne	Fisher Naukowy	08-945
15 ml probówki ze stożkową nakrętką, sterylne	BD Sokół	352097
50 ml probówki ze stożkową nakrętką, sterylne	BD Sokół	352027
Pipeta serologiczna 10 ml, sterylna	Corning	13-678-11E
Tłok strzykawki 6 ml, sterylny	Tyco Opieka zdrowotna	8881516911
Filtr nylonowy (70 μm) sitko komórkowe, sterylny	BD Sokół	Numer katalogowy: 352350
Szalka Petriego 5 cm, sterylna	Corning	430166
Szalka Petriego 10 cm, sterylna	Corning	430167