Uzyskiwanie komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych: metoda hodowli komórek nabłonkowego raka jajnika z próbek guza jajnika

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przetwarzanie tkanek

1. Pracując w sterylnych warunkach, przenieść próbki na szalkę Petriego (60 mm x 60 mm) zawierającą 10 ml świeżego, lodowatego PBS i za pomocą sterylnej żyletki pociąć na najmniejsze możliwe kawałki (2 mm lub mniej) (rysunki 1A i 1B).
2. Przenieść rozdrobnione tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml podgrzanej (37 °C przez 30 min) dypazy II (2,4 U/ml) w DMEM i inkubować w temperaturze 5% CO₂ i 37 °C przez 30 min. Aby zapewnić optymalne trawienie próbek, należy ręcznie mieszać zawiesinę komórkową co 5 minut.
3. Po 30 minutach inkubacji przenieść (za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml) zawiesinę komórek na sitko do komórek (oczko 70 μm) umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie docisnąć siatkę za pomocą tłoka strzykawki. Odrzucić wszelką niezdysocjowaną tkankę (pozostałą na wierzchu siatki) i zebrać otrzymaną zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 320 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 2).
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml DMEM zawierającym 10% FBS.
5. Zawiesinę komórkową inkubować na płytce Petriego w temperaturze 5% CO₂ i temperaturze 37 °C (ryc. 3).
6. Zmienić podłoże po 24 godzinach od pierwszego poszycia. Pozwala to na usunięcie resztek komórkowych i większości erytrocytów obecnych w hodowli.
7. Zmieniaj pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym kultury pierwotnego EOC są gotowe do dalszych zastosowań.

Rysunek 1. Przetwarzanie próbek klinicznych. A) Próbka stała przeniesiona na szalkę Petriego zawierającą 10 ml świeżej, lodowatej próbki 1x PBS. B) Próbki kliniczne dalej pocięte na kawałki o wielkości około 2 mm

Rysunek 2. Oddzielenie komórek EOC od niezdysocjowanych tkanek. Po trawieniu enzymatycznym próbki kliniczne są przenoszone na sitko do komórek, a strawione próbki kliniczne są delikatnie uciskane za pomocą tłoka strzykawki. Pozwala to na mechaniczne oderwanie EOC od tkanek łącznych i odzyskanie komórek EOC

Rysunek 3. Posiewanie powstałej zawiesiny komórek EOC. Po usunięciu wszelkich niezdysocjowanych tkanek zawiesinę komórkową odwirowuje się i ponownie zawiesza w 10 ml DMEM zawierającej 10% FBS i inkubuje na płytce Petriego w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C