1. Tworzenie sferoidów komórek raka jajnika
- Komórki raka jajnika wykazujące ekspresję RFP są hodowane w 10% pożywce podstawowej (niestandardowa pożywka do hodowli komórkowej zawierająca mieszaninę 199 i MCDB105 w proporcji 50:50, 10% inaktywowaną płodową surowicę bydlęcą i 1% paciorkowca). Aby wyrazić RFP w nieznakowanych komórkach raka jajnika, należy transfekować komórki plazmidem zawierającym RFP i wybrać komórki wykazujące ekspresję RFP. Alternatywnie, wektory wirusowe mogą być używane do przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych lub komórki mogą być wstępnie inkubowane z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do śledzenia komórek (Invitrogen).
- Przed utworzeniem sferoid raka jajnika konieczne jest przygotowanie 96-dołkowych naczyń z okrągłym dnem o niskiej adhezji. Aby wytworzyć płytki hodowlane o niskiej adhezji, dodaj 30 μl roztworu poli-HEMA (6 mg polihydroksyetylometakrylanu w 1 ml 95% EtOH) do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. 96-dołkowe płytki inkubuje się w nienawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu odparowania etanolu, pozostawiając warstwę poli-HEMA na każdym dołku. Ta folia z poli-HEMA zapobiega przyczepianiu się komórek do dna studzienki, zmuszając komórki do wzrostu w zawiesinie. [Alternatywnie można użyć płytek hodowlanych Ultra-Low Attachment (Corning).]
- Następnie trypsynizuj komórki raka jajnika, osadzaj komórki w wirówce stołowej (Heraeus) przy 900 RCF przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10% pożywce podstawowej.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Dostosuj stężenie komórek tak, aby na 50 μl 10% pożywki zasadowej przypadało 100 komórek.
- Dodać 50 μl równomiernie zawieszonej zawiesiny rozcieńczonych komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej poli-HEMA.
- Inkubować 96-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 16 godzin (czas ten należy wydłużać lub zmniejszać w zależności od czasu potrzebnego danej linii komórkowej do wytworzenia wielokomórkowych sferoid lub pożądanych warunków eksperymentalnych), aby umożliwić komórkom raka jajnika skupienie się razem, tworząc pojedynczą wielokomórkową sferoidę w każdym dołku. Niektóre komórki nowotworowe mogą ulegać apoptozie w tym okresie, dlatego ważne jest, aby wybrać czas przed indukcją apoptozy.
2. Tworzenie jednowarstwowych komórek międzybłonka
- W kapturze do hodowli komórkowych wstępnie pokryj studzienki 6-dołkowego naczynia MatTek ze szklanym dnem fibronektyną, dodając 2 ml 5 μg roztworu fibronektyny/ml PBS do każdej studzienki naczynia i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Jakość optyczna szklanych dna w naczyniach MatTek pozwala na obrazowanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości.
- Komórki międzybłonka wykazujące ekspresję GFP są hodowane w 10% pożywce podstawowej. Trypsynizuj płytkę z komórkami międzybłonka, wiruj w wirówce stołowej (Heraeus) z prędkością 900 obr./min przez 3 minuty, odessaj supernatant i ponownie zawiesij w 10% pożywce podstawowej. Użyte tutaj komórki międzybłonka już wyrażały GFP, gdy zostały uzyskane, ale nieznakowane komórki międzybłonka mogą być wytwarzane przez transfekcję plazmidem zawierającym cDNA GFP lub wstępną inkubację komórek w zielonym fluorescencyjnym barwniku śledzącym komórki (Invitrogen).
- Po 30-minutowej inkubacji fibronektyny (w kroku 2.1) umyj studzienki naczynia MatTek 2 ml PBS.
- Odessać PBS i płytkę 6 x105 komórek międzybłonka na studzienkę w każdym dołku 6-dołkowej płytki MatTek. Inkubować szalkę MatTek w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić komórkom międzybłonka przyczepienie się do naczynia i utworzenie monowarstwy.
3. Test oczyszczania komórek międzybłonkowych
- Użyj pipety, aby pobrać sferoidy raka jajnika z 96-dołkowej płytki pokrytej poli-HEMA.
- Odessać pożywkę z jednego dołka 6-dołkowej płytki MatTek zawierającej monowarstwę komórek międzybłonka. Umyć raz 2 ml PBS. Dodaj wszystkie sferoidy z płytki 96-dołkowej do jednego dołka szalki MatTek (~3x liczba sferoid, które zostaną zobrazowane, aby uwzględnić sferoidy lądujące na części szalki, której nie można zobrazować).
- Umieść szalkę MatTek na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu, który jest w stanie wykonywać obrazowanie poklatkowe przez co najmniej 8 godzin. Użyj zmotoryzowanej stolika, aby zobrazować wiele pozycji w czaszy, z wieloma zdarzeniami interkalacji sferoidów, w jednym eksperymencie. Używamy mikroskopu poklatkowego Nikon Ti-E Inverted Motorized Widefield Fluorescence Time-Lapse ze zintegrowanym systemem Perfect Focus System i optyką o niskim powiększeniu [20x-0,75 apertury numerycznej (NA)], kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC) NA, transiluminatora halogenowego Nikon z kondendensem dalekiej odległości roboczej (LWD) 0,52 NA, szybkich (czas przełączania <100 milisekund) filtrów wzbudzenia i emisji Nikon (GFP Ex 480/40, Em 525/50), RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), szybkie przechodzące i epifluorescencyjne ścieżki światła Smart Shutters firmy Sutter, zmotoryzowany stolik z kodowaniem liniowym firmy Nikon, chłodzona kamera ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) Hamamatsu ORCA-AG, specjalnie zbudowana komora inkubacyjna mikroskopu z kontrolą temperatury i CO2 , oprogramowanie Nikon NIS-Elements AR w wersji 3 oraz stół do izolacji drgań TMC.
- Sferoidy komórek raka jajnika osiądą na dnie naczynia i przyczepią się do monowarstwy komórek międzybłonka. Zbieraj obrazy GFP, RFP i fazowe 20+ interakcji sferoida/monowarstwa co 10 minut, przez 8 godzin.
- Sferoidy komórek raka jajnika wyrażające RFP zaatakują monowarstwę komórek międzybłonka wyrażających GFP, tworząc dziurę w monowarstwie. Po 8 godzinach zmierz rozmiary, śledząc czarne na obrazach GFP za pomocą oprogramowania Elements (lub innego odpowiedniego oprogramowania, takiego jak obraz J). Znormalizuj rozmiar otworu do początkowego rozmiaru sferoidy, dzieląc rozmiar otworu po 8 godzinach przez rozmiar sferoidy na odpowiednim obrazie zapytania ofertowego w czasie zero. W tym przykładzie rozmiar otworu został zmierzony tylko raz, ale można go zmierzyć wiele razy w ciągu ośmiogodzinnego eksperymentu, aby lepiej zrozumieć dynamikę interkalacji.
