Test klirensu międzybłonkowego: technika in vitro do ilościowego określania zdolności infekcji sferoid raka jajnika do monowarstw komórek międzybłonka

Streszczenie

Źródło: Davidowitz, R. A. et al. Test klirensu międzybłonkowego in vitro, który modeluje wczesne etapy przerzutów raka jajnika. J. Vis. Exp.(2012)

Ten film opisuje technikę ilościowego pomiaru interakcji sferoid raka jajnika z komórkami międzybłonka, przy użyciu komórek znakowanych fluorescencyjnie i mikroskopii poklatkowej. Ten test in vitro modeluje interakcję między sferoidami komórek raka jajnika z przerzutami a komórkami międzybłonka wyściełającymi jamę otrzewnej in vivo.

Protokół

1. Tworzenie sferoidów komórek raka jajnika

1. Komórki raka jajnika wykazujące ekspresję RFP są hodowane w 10% pożywce podstawowej (niestandardowa pożywka do hodowli komórkowej zawierająca mieszaninę 199 i MCDB105 w proporcji 50:50, 10% inaktywowaną płodową surowicę bydlęcą i 1% paciorkowca). Aby wyrazić RFP w nieznakowanych komórkach raka jajnika, należy transfekować komórki plazmidem zawierającym RFP i wybrać komórki wykazujące ekspresję RFP. Alternatywnie, wektory wirusowe mogą być używane do przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych lub komórki mogą być wstępnie inkubowane z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do śledzenia....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
OVCA433 Komórki raka jajnika			Prezent od dr Dennisa Slamona
Komórki międzybłonkowe ZT			Prezent od dr Tan Ince
Średni 199	GIBCO firmy Life Technologies	Rok 19950
MCDB105	Aplikacje komórkowe Inc.	Nr kat. 117-500
FBS - ciepło dezaktywowane	GIBCO, firmy Life Technologies	Numer katalogowy: 10082
Pióro-paciorkowiec	GIBCO, firmy Life Technologies	Numer katalogowy: 15070
Płytki 96-dołkowe	Corning	Numer katalogowy: 3799
Polihydroksyetylometakrylan (poli-HEMA) 192066-25G	Sigma-Aldrich		Aby uzyskać roztwór poli-HEMA, rozpuść 6 mg proszku poli-HEMA w 1 ml 95% EtOH
EtOH (EtOH	Pharmco-AAPER	Numer katalogowy: 111ACS200	Rozcieńczyć do 95% w dH20
Kaptur do hodowli komórkowych	Nuaire powiedział:	NU-425-300
Inkubator do hodowli tkankowych	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Numer katalogowy: 3110
Inkubator do płytek poli-HEMA 305	Instrumenty laboratoryjne	Cesarski III
Wirówka stołowa	Instrumenty Heraeusa	75003429/01
Naczynie ze szklanym dnem 6 dołków	MatTek Corp.	P06G-1.5-20-F
Fibronektyna	Sigma-Aldrich	F1141-1MG
Pbs	Komórka	21-040-CV
mikroskop	Instrumenty firmy Nikon		Odwrócony zmotoryzowany fluorescencyjny mikroskop poklatkowy Ti-E ze zintegrowanym systemem Perfect Focus
soczewka	Instrumenty firmy Nikon		Przysłona numeryczna 20X-0,75
Transformator halogenowy	Instrumenty firmy Nikon		Skraplacz o dużej odległości roboczej 0,52 NA
Filtry wzbudzenia i emisji	Chroma Technology Corp.		GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFPmCherry Ex 575/50 Em 640/50
Ścieżka światła przechodzącego i epifluorescencji	Instrument Sutter Co.		Inteligentne migawki
Stopień silnikowy kodowany liniowo	Instrumenty firmy Nikon
Chłodzona, ładowana kamera sprzętowa	Hamamatsu Corp.	ORCA-AG
Mikroskopowa komora inkubacyjna z kontrolą temperatury i CO2			Wykonane na zamówienie
Stół wibroizolacyjny	TMC (Międzynarodowa Organizacja T
Oprogramowanie NIS-Elements	Instrumenty firmy Nikon		Wersja 3

TGL )