$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. System aplikacji pól TTFields in vitro - konserwacja płytki bazowej i naczynia
- Opłucz naczynia i pokrywki naczyń pod bieżącą bieżącą wodą. Następnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.
- Jeśli w poprzednim eksperymencie do potraw dodano chemioterapeutyk/lek, napełnij każde naczynie 5% lekkim roztworem detergentu i pozostaw na noc.
- Dokładnie opłucz naczynia pod bieżącą bieżącą wodą, aby uniknąć śladów detergentu wewnątrz naczynia. Opłucz naczynia i pokrywki naczyń wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu twarzą w dół.
- Włóż czyste i suche naczynia wraz z pokrywkami do worków sterylizacyjnych. Zamknij i umieść worki w autoklawie, naczyniami skierowanymi do dołu. Autoklaw przez 30 minut w temperaturze nie wyższej niż 121 °C.
- Ustaw autoklaw na program suszenia, częściowo otwórz drzwiczki autoklawu i susz naczynia przez 30 minut.
- Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.
2. Konfiguracja eksperymentu
UWAGA: Wszystkie urządzenia i materiały użyte w tym protokole są opisane na Liście Materiałów. Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym, przy zachowaniu sterylnych warunków.
- Należy przygotować czyste i sterylne naczynia i pokrywki pól TTFields, zgodnie z opisem w punkcie 1. Przetrzyj płytę podstawy szmatką lekko zwilżoną 70% etanolem.
- Zamontuj naczynia TTFields z pokrywami na płycie podstawy, delikatnie dociskając naczynie i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara o około 5 mm, aż krawędź naczynia zablokuje się na trzech kołkach na płycie podstawy. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm (plastik lub szkło poddane obróbce) na dnie każdego naczynia.
- Przygotować zawiesinę komórkową w kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco dla U-87 MG i F98; RPMI dla A2780 i OVCAR-3; uzupełnione zgodnie z opisem w Wykazie materiałów).
UWAGA: Stężenia komórek zależą od typów komórek i czasu trwania eksperymentu; Do końca eksperymentu nie należy przekraczać 80%-90% zlewającego się wzrostu komórek.
UWAGA: Ludzkie linie komórkowe mogą stanowić zagrożenie biologiczne i należy się z nimi obchodzić z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa.
- Umieść 200 μl zawiesiny komórek (zwykle 5 000-20 000 komórek w 200 μl na 72-godzinny eksperyment, w zależności od czasu podwojenia) jako kroplę na środku każdego szkiełka nakrywkowego i przykryj pokrywkami naczynia.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do momentu, gdy komórki się zgrzebią; na tym etapie możliwa jest inkubacja przez noc.
- Odessać płyny z kropli za pomocą pipety o pojemności 200 lub 1 000 μl.
- Delikatnie odpipetuj 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby napełnić każde naczynie. Do pipetowania użyj sterylnej końcówki i delikatnie postukaj w krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić pęcherzyki powietrza, które od czasu do czasu znajdują się pod szkiełkiem.
- Przykryć naczynia pokrywkami i umieścić je w inkubatorze wykorzystującym CO2 w temperaturze 37 °C do czasu rozpoczęcia leczenia polami TTFields.
3. Aplikacja pól TTFields
- Przenieść płytki podstawy z dołączonymi szalkami TTFields do inkubatoraCO2 z chłodzeniem.
UWAGA: Stosowanie pól elektrycznych TTFields in vitro powoduje wytwarzanie ciepła; Dlatego wymagany jest inkubator z chłodzeniem, aby skompensować nagrzewanie się potraw. Wyższe intensywności pól TTFields będą wytwarzać więcej ciepła i będą wymagały niższych temperatur otoczenia w inkubatorze (patrz Tabela 1). Klinicznie istotne natężenia pól TTFields uzyskuje się, gdy temperatura w inkubatorze do stosowania pól TTFields mieści się w zakresie 18–30 °C.
- Podłącz złącze żeńskie płaskiego do płyty podstawy. Włączyć generator pól TTFields.
- Uruchomić oprogramowanie systemowe do stosowania pól TTFields do stosowania in vitro i wybrać ustawienia eksperymentu.
- Zdefiniuj nowy eksperyment. Wpisz nazwę eksperymentu i właściciela eksperymentu w interfejsie użytkownika oprogramowania na ekranie komputera. Dostosuj częstotliwość i temperaturę docelową dla każdego naczynia lub płyty podstawy.
- Uruchom aplikację TTFields za pomocą oprogramowania.
- Sprawdź, czy wszystkie naczynia są prawidłowo podłączone i są wyświetlane na niebiesko na monitorze. Jeśli antena jest otoczona czerwoną ramką (co oznacza, że nie jest prawidłowo podłączona), delikatnie ją dociśnij i powoli obracaj w przód iw tył, aż styki zostaną przywrócone, a antena zmieni kolor na jasnoniebieski.
- Pozostawić uruchomione pola elektryczne TTFields do stosowania in vitro na okres do 24 godzin.
- Jeśli eksperyment osiągnie punkt końcowy, przerwij go, klikając przycisk ZAKOŃCZ EKSPERYMENT w oprogramowaniu i przejdź do kroku 5. Jeśli nie, kliknij PAUZA eksperyment.
- Odłącz złącze płaskiego od płyty podstawy. Wyjmij płytę podstawy z naczyniami z inkubatora do komory z przepływem laminarnym.
- Wymieniaj pożywkę we wszystkich naczyniach co 24 godziny i włóż płytę podstawy z powrotem do inkubatora z chłodzeniem. Podłącz płytę podstawy do generatora za pomocą płaskiego. Kontynuuj eksperyment, klikając przycisk KONTYNUUJ.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
| Temperatura otoczenia inkubatora | Oczekiwana intensywność pól TTFields |
| (°C) | (V/cm RMS) |
| Rozdział 18 | 1,62 |
| Rozdział 19 | 1,55 |
| 20 | Godzina 1,48 |
| 21 | Rozdział 1,41 |
| 22 Rozdział 22 | 1,33 |
| 23 | Pytanie 1,26 |
| 24 | Pytanie 1,19 |
| 25 | Pytanie 1,12 |
| 26 | Klasa 1,04 |
| 27 Rozdział 27 | 0,97 |
| 28 | 0,9 |
| 29 | 0,83 |
| Rozdział 30 | 0,76 |
Tabela 1. Temperatura otoczenia inkubatora i oczekiwane natężenie pól TTFields wewnątrz naczynia pola TTFields.
4. Próbki kontrolne
Uwaga: Hoduj komórki kontrolne w podobnych warunkach do komórek poddanych działaniu pól TTFields, z wyłączeniem stosowania pól TTFields.
- Płytki kontrolne próbek z tą samą zawiesiną i na podobnej powierzchni, używane do powlekania próbek poddanych działaniu pól TTFields.
- Umieścić szalki kontrolne w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
- Pożywkę należy wymieniać w naczyniach co 24 godziny, aby dopasować ją do warunków podłoża poddanego działaniu pól TTFields.
5. Koniec eksperymentu
- Po kliknięciu na ZAKOŃCZ EKSPERYMENT poczekaj, aż oprogramowanie pobierze wszystkie rekordy z systemu i zapisze je na komputerze.
- Użyj przycisku RAPORTY, aby przejrzeć pliki dziennika temperatury, prądu i rezystancji każdej płytki podstawowej, aby sprawdzić, czy wszystkie naczynia zostały potraktowane zgodnie z planem eksperymentalnym.
UWAGA: Wszystkie raporty i dzienniki są zapisywane na komputerze po zakończeniu eksperymentu i można je przeglądać w dowolnym momencie.
- Wyłączyć generator pól TTFields.
- Odłącz płaski od płyty podstawy i wyjmij go z inkubatora.
- Aby wyjąć naczynie ceramiczne, naciśnij i obróć naczynie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby odblokować je z podstawy.
- Umieść naczynia w komorze z przepływem laminarnym i aseptycznie usuń szkiełka nakrywkowe. Przenieść je na sterylne szalki Petriego zawierające świeżą pożywkę lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu dalszej kontroli i oceny.