Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Sharrow, A. C. et al. Wykorzystanie błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych. J. Vis. Exp.(2020)

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie zawiesiny komórek rakowych do przeszczepu (opcja 1)

UWAGA: To powinno być zakończone tuż przed implantacją, która powinna mieć miejsce między 7 a 10 dniem. Prosimy o zapoznanie się z uwagami na początku kroku 3 lub 4 w celu uzyskania dalszych informacji na temat daty implantacji. Podejście to zastosowano dla wszystkich linii komórkowych i hodowlanych trawień guza raka nerki.

1. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie.
2. Stosując trawienie mechaniczne i/lub enzymatyczne, należy uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki przy użyciu metody odpowiedniej dla typu wszczepianej komórki.
3. Zawiesić całkowitą liczbę komórek, które mają zostać wszczepione, w odpowiednim podłożu do implantacji. Typowe są implanty 1-2 x 10⁶ komórek na jajo.
   nuta: Pożywka używana do implantacji linii komórkowych jest zazwyczaj kompletną pożywką używaną do hodowli komórek, zawierającą FBS lub wymianę surowicy. Implantacja trawień nowotworowych zazwyczaj wykorzystuje kompletną pożywkę używaną do hodowli linii komórkowych tego samego typu raka. Jednakże w razie potrzeby eksperymentalnie można wprowadzić zmiany w składzie pożywki. Wpływ na rozwój i wzrost guza musiałby zostać określony empirycznie.
4. Granulować komórki, używając prędkości wirówki i czasu odpowiedniego dla używanych komórek. Typowe prędkości to 250-300 x g, a czasy to 5-10 min.
5. Usunąć supernatant z granulowanych komórek za pomocą pipetowania. Mechanicznie zawiesić komórki w pozostałym podłożu za pomocą trzepotania lub pipetowania. Ułóż na lodzie do ostygnięcia. Zmierz objętość komórek i podłoża za pomocą pipety o odpowiedniej wielkości.
6. Obliczyć objętości implantacji w taki sposób, aby 1-2 x 10⁶ komórek wszczepia się w objętości 20-100 μl na jajo o końcowym stężeniu w macierzy zewnątrzkomórkowej 2,7-4 mg/ml białka. Dodaj pożywkę, dowolne pożądane czynniki wzrostu lub dodatki i roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z tym obliczeniem. Przechowywać na lodzie, aż będzie gotowy do implantacji.
   nuta: Do obliczeń w krokach 1.3 i 1.6 należy włączyć dodatkową objętość co najmniej połowy implantu jajowego, aby zapewnić odpowiednią objętość dla wszystkich jaj w grupie. W celu implantacji linii komórkowych raka jajnika (tj. SKOV3 i ID8) wszczepiono 10⁶ komórek z komórki jajowej. Do implantacji linii komórkowej raka nerkowokomórkowego RENCA wszczepiono hodowane komórki pochodzące z strawionego pierwotnego ludzkiego raka nerkowokomórkowego, linii komórkowych raka prostaty (tj. CWR, C4-2 i MyC-CaP) oraz linii komórkowych raka pęcherza moczowego (tj. HT-1376 i T24), wszczepiono 2 x 10⁶ komórek.

2. Przygotowanie fragmentów guza do implantacji (opcja 2)

UWAGA: To powinno być zakończone tuż przed implantacją, która powinna mieć miejsce między 7 a 10 dniem. Prosimy o zapoznanie się z uwagami na początku kroku 3 lub 4 w celu uzyskania dalszych informacji na temat daty implantacji. Pierwotne nowotwory jajnika i pęcherza moczowego wszczepiano w postaci fragmentów guza.

1. Rozmrozić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Rozcieńczyć do końcowego stężenia białka 2,7-4 mg/ml w odpowiednim podłożu zawierającym pożądane czynniki wzrostu lub dodatki. Przechowywać na lodzie.
   nuta: Implantacja fragmentów guza zazwyczaj wykorzystuje kompletne podłoże używane do hodowli linii komórkowych tego samego typu raka. Jednakże w razie potrzeby eksperymentalnie można dokonać zmian w postaci podłoża. Wpływ na wszczepienie i wzrost guza musiałby zostać empirycznie określony.
2. Za pomocą skalpela lub nożyczek wyciąć kawałki świeżego guza. Idealne rozmiary wahają się od 2 do 5 mm z każdej strony. Utrzymuj tkanki zanurzone w pożywce, aż będą gotowe do implantacji.

3. Implantacja za pomocą pierścienia zapobiegającego przywieraniu (opcja 1)

UWAGA: Komórki mogą być wszczepiane począwszy od 7 dnia rozwoju, jeśli CAM jest w pełni rozwinięty. Implantacja może nastąpić w dowolnym momencie przed wykluciem, co daje odpowiedni czas na rozwój guza i pożądany eksperyment, ale należy pamiętać, że komórki odpornościowe zarodka zaczynają być obecne około 10 dnia po zapłodnieniu. Tempo wzrostu guza różni się znacznie w zależności od typu komórki i musi być empirycznie określone dla typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Komórki raka jajnika i raka prostaty wszczepiono metodą pierścienia zapobiegającego przywieraniu. Należy pamiętać, że jeśli pierścień zapobiegający przywieraniu nie jest dostępny, końcówkę pipety można przyciąć do podobnego rozmiaru i użyć.

1. Użyj 70% etanolu do dezynfekcji szafki bezpieczeństwa biologicznego i wszystkich wymaganych narzędzi: stojaka na jajka, zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, nieprzywierających pierścieni (średnica wewnętrzna 1/4 cala), szklanego pręta do mieszania, pipet i końcówek o odpowiedniej objętości, przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm, nożyczek biurowych oraz markera lub ołówka. Jeśli to możliwe, należy używać narzędzi sterylnych, jednorazowych lub autoklawowanych.
2. Umieść jaja do zagnieżdżenia na stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wybierz możliwą do opanowania liczbę jaj. Typowo jest do sześciu. Unikaj dopuszczenia do znacznego ostygnięcia jaj podczas pracy z nimi.
3. Usuń przezroczysty opatrunek foliowy z muszli, zwijając krawędzie w kierunku otwartego okna, aby uniknąć odrywania kawałków skorupy. Sprawdź, czy jaja są żywotne i zdrowe. Idealne jaja będą miały duże naczynie pośrodku otwartego obszaru, z którego odgałęziają się mniejsze naczynia.
4. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki umieść sterylny, nieprzywierający pierścień na CAM nad naczyniem, najlepiej nad punktem rozgałęzienia. Użyj sterylnego szklanego pręta mieszającego, aby delikatnie zetrzeć CAM.
5. Odpipetować zawiesinę ogniw z kroku 1.6 do środka pierścienia zapobiegającego przywieraniu. Alternatywnie, za pomocą kleszczy umieść fragment guza z kroku 2.2 w środku pierścienia zapobiegającego przywieraniu i przykryj 20-50 μl roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej wygenerowanego w kroku 2.1.
6. Uszczelnij otwór jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach 6 x 7 cm. Oznacz jaja odpowiednim oznaczeniem implantu.
   nuta: Numerowanie jaj w grupie ułatwia obserwacje podłużne.
7. Włóż jajo z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że otwór skorupki jest ustawiony pionowo, a jajko jest bezpieczne.
   nuta: Jaja można wnosić do inkubatora bez rotacji. Alternatywnie, wysoką żywotność po implantacji można uzyskać za pomocą inkubatora komórkowego o temperaturze 37-38 °C z dezaktywowanym CO₂ i higrometrem do monitorowania wilgotności, która powinna wynosić 50%-80%.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
010 Teflon (PTFE) Biały 55 O-ringi Duro Shore D	Sklep z O-ringami	TEF010	Nieprzywierający pierścień do wysiewu komórek. 1/4 "ID X 3/8" OD X 1/16 "CS Politetrafluoroetylen (PTFE).
Delikatne nożyczki operacyjne; Zakrzywiony; ostry-ostry; 30mm Długość ostrza; 4-3/4 cala Długość całkowita	Roboz Chirurgiczny	Złącze RS6703	Jest to podane jako przykład. Wszelkie podobne zakrzywione nożyczki również by się sprawdziły.
Zestaw narzędzi Dremel 8050-N/18 Micro 8 V Max	Dremel	8050-N/18	Ten zestaw zawiera wszystkie niezbędne narzędzia
Zapłodnione jaja kurze (Rhode Island Red - Brown, klasa laboratoryjna)	AA Lab Jaja Inc.	N/a	Konieczne byłoby zidentyfikowanie lokalnego dostawcy jaj, ponieważ ten dostawca dostarcza jaja tylko regionalnie.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Zestaw Combo do inkubatora do jaj	Magazyn inkubatora	HB1588D-BRAK-1102-1588-1357	Mogą być stosowane inne inkubatory do jaj, ale ich niezawodność musiałaby zostać zweryfikowana. Po implantacji można również zastosować inkubator komórkowy z wyłączonym CO2
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Magazyn inkubatora	Numer katalogowy 1102	Można użyć innych świec, jednak jest to preferowane spośród tych, które testowaliśmy. Ten świecownik znajduje się we wspomnianym zestawie inkubatora.
Matrigel Membrana Matrix HC; Nie zawiera LDEV	Corning	354248	Roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej
SKOV3	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-77	Linia komórkowa ludzkiego raka jajnika.
Pręty mieszające z gumą Policeman; średnica 5 mm, długość 6 cali	Zjednoczone Zaopatrzenie Naukowe	GRPL06	Jest to podane jako przykład. Wszelkie podobne szklane pręty do mieszania również by się sprawdziły.
Kleszcze do próbek	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 72914	Jest to podane jako przykład. Kleszcze służące do odciągania skorupy do obrazowania bioluminescencyjnego mają około 12,8 cm długości i końcówki o szerokości 3 mm.

powiedział: . TGL powiedział: