Izolacja i hodowla komórek nabłonka języka myszy: procedura izolacji i hodowli komórek nabłonka języka z modelu mysiego

Streszczenie

Źródło: Prasad, M. et al. in vitro stworzenie genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu wirusa Cas9 związanego z adeno. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie opisujemy izolację komórek nabłonkowych z mysiego języka. Komórki te mogą być dalej hodowane, aby dać początek koloniom komórkowym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja i hodowla komórek pierwotnych

1. Poddanie eutanazji 6-tygodniowego chłopca lub samicy witaminy B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J przez uduszenie CO₂ lub dowolny inny protokół zatwierdzony przez IACUC.
   nuta: Te myszy knockin CRISPR / Cas9 mają zależną od rekombinazy Cre ekspresję endonukleazy cas9 i EGFP kierowaną przez promotor CAG. Sekwencja Lox-Stop-Lox (LSL) obecna w genomie tych myszy zapobiega ekspresji Cas9 i EGFP przy braku rekombinazy Cre. W połączeniu z pojedynczymi przewodnikowymi RNA (sgRNA) i źródłem Cre umożliwiają edycję jednego lub wielu genów myszy in vivo lub ex vivo.
2. Wypreparuj język myszy poddanych eutanazji za pomocą nożyczek chirurgicznych.
3. Ręcznie rozdziel tkankę, mieląc tkankę języka na bardzo małe fragmenty za pomocą skalpela. Zbierz fragmenty tkanek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4,5 ml zwykłej pożywki RPMI (bez surowicy).
4. Dodać potrójną mieszankę enzymów (200 μl) (receptura patrz tabela 1) do fragmentów tkanki.
5. Inkubować mieszaninę tkankowo-enzymatyczną w temperaturze 37 °C przez 30 minut i stukać w probówkę co 10 minut, aby zwiększyć dysocjację enzymatyczną tkanki.
6. Dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej HBSS/PBS do mieszaniny tkankowo-enzymatycznej, aby zatrzymać działanie enzymu.
7. Przefiltruj powyższą zawiesinę komórek przez sterylną siatkę nylonową o grubości 70 μm, aby oddzielić rozproszone komórki i większe fragmenty tkanek.
8. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przepłukać przez odwirowanie przez 300 x g przez 5 minut w HBSS/PBS w temperaturze pokojowej.
9. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (10% FBS w RPMI/DMEM) i hodować na szalkach hodowlanych o średnicy 60 mm, aż utworzą się odrębne kolonie komórek.
   1. Agregaty komórek hodowlanych są zatrzymywane na górze filtra w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm zawierającym 3 ml kompletnej pożywki (10% FBS w RPMI/DMEM) do momentu utworzenia kolonii komórkowych.
10. Zbadaj mikroskopowo komórki pierwotne pod kątem obecności zanieczyszczenia fibroblastami po 1 tygodniu hodowli. Traktuj pierwotne komórki powstałe z agregatów i zawiesin komórkowych 0,25 trypsyny 0,02% roztworu EDTA w temperaturze 37 °C przez 1 minutę w celu usunięcia fibroblastów.
    nuta: Zwykle pierwotna hodowla z agregatów komórkowych wytwarza więcej kolonii w porównaniu z zawiesinami jednokomórkowymi. Komórki z tych kolonii zapewniają lepszą wydajność transdukcji dzięki transdukcji AAV.

10X Potrójny roztwór podstawowy enzymu:
Kolagenaza	1 g stężenia końcowego [10 mg/ml]
Hialuronidazy	100 mg [1 mg/ml]
Strefa DNaza	20 000 jednostek stężenie końcowe [200 mg/mL]
PBS 1X	Uzupełnić do 100 ml

Tabela 1: Receptura buforu zastosowana w tym badaniu

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczepy myszy
Zobacz materiał C57BL/6	Envigo (Envigo)
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)Fezh/J	Laboratoria Jacksona	Numer katalogowy: 24857
skinienie. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)	Envigo (Envigo)
enzymy
Benzonaza	Sigma	E1014
Kolagenaza IV	Thermo Fisher Naukowy	17104019
DNAzy	Thermo Fisher Naukowy	18047019
Hialuronidazy	MiliporeSigma	H3506
trypsyna	Przemysł biologiczny Izrael BeitHaemek Ltd.	03-050-1B
Pożywki hodowlane, chemikalia i odczynniki
Bsa	Amresco (angielski)	0332-TAM-50G
DMEM (DMEM)	Przemysł biologiczny Izrael BeitHaemek Ltd.	01-055-1A
FBS (Sieć Usługowa	Przemysł biologiczny Izrael BeitHaemek Ltd.	04-127-1A
HBSS (Sieć HBSS)	Sigma	Zobacz materiał H6648
Pbs	Przemysł biologiczny Izrael BeitHaemek Ltd.	02-023-1A
Bufor Tris	MERCK Millipore	Nr kat. 648311-1KG
Wyroby z tworzyw sztucznych
Filtr Amicon-ULTRA 100 KDa	Milipory	UFC910024
Filtry sterylne 0,22 μm, 4 mm	Młyny Millex	SLGV004SL
Filtry sterylne 0,45 μm, 13 mm	Młyny Millex	SLHV013SL
Płytki hodowlane	Greiner Bio-One
Rurki Falcon	Greiner Bio-One

powiedział: powiedział: