Wstępna obróbka tkanek FFPE dla RNA CISH: procedura przetwarzania skrawków tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie do chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ

Streszczenie

Źródło: Outh-Gauer, S. et al. Chromogeniczna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnozowania raka głowy i szyi związanego z HPV. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje kroki związane z wstępną obróbką próbek tkanek FFPE pod kątem chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Proces obróbki wstępnej pomaga utrzymać integralność kwasów nukleinowych w komórkach i ogólną morfologię tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotowanie 1x odczynnika do odzyskiwania celu
   1. W dużej zlewce dodać 70 ml 10-krotnego odczynnika do odzyskiwania tarczy (patrz tabela materiałów) do 630 ml wody destylowanej.
   2. Umieść zlewkę na płycie grzewczej z mieszadłem magnetycznym. Przykryj folią aluminiową.
   3. Gotować jego zawartość w temperaturze 100 °C przez 10–15 min.
      UWAGA: Nie pozwól, aby wrze dłużej niż 30 minut.

2. Wstępne leczenie tkanek

UWAGA: Te kroki są zgodne ze "standardowym" zaleceniem obróbki wstępnej zgodnie z instrukcjami producenta dla próbek głowy i szyi. Czas wykonania sekcji 2.1 i 2.2 może wymagać dostosowania w zależności od manipulowanej tkanki.

1. Blokada aktywności peroksydazy
   1. Dodać 4-6 kropli nadtlenku wodoru (patrz tabela materiałów) do każdego szkiełka i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Myj szkiełka 2x przez 2 min w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej.
2. Zerwanie wiązań RNA/tkankowych
   1. Za pomocą pazura wyjmij folię aluminiową z wrzącego 1x odczynnika do odzyskiwania celu (TTR1x) umieszczonego na płycie grzewczej i przestań mieszać. Zanurz ruszt na szkiełka powoli i bardzo ostrożnie na 15 minut. Ponownie przykryj zlewkę folią aluminiową.
      nuta: Na tym etapie gotowanie na wolnym ogniu musi być kontynuowane.
      ostrożność: Użyj pazura, aby manipulować folią aluminiową i stojakiem na suwaki, aby uniknąć oparzeń. Upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.
   2. Za pomocą pazura natychmiast przenieś gorący stojak na szkiełka do kąpieli destylowanej i myj go przez 2 min.
      nuta: Upewnij się, że próbki nie ostygną w TTR1x.
   3. Myj szkiełka w świeżym 100% etanolu przez 2 minuty.
   4. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
3. Tworzenie barier
   1. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (patrz Tabela materiałów) narysuj barierę wokół próbki. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 5 min.
      nuta: Pozwól, aby bariera naprawdę wyschła. Jeśli zużyje się podczas zabiegu, nie wahaj się go ponownie narysować. Unikać dotykania chusteczki wstrzykiwaczem. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na noc.
4. Trawienie proteazy
   1. Umieść szkiełka na stojaku na szkiełka i dodaj ~4 krople Protease Plus na próbkę (patrz Tabela materiałów).
   2. Przykryj tackę do kontroli wilgotności pokrywką i włóż ją do pieca do hybrydyzacji na 30 minut w temperaturze 40 °C.
      nuta: Aby zapobiec parowaniu, upewnij się, że pokrętło jest całkowicie obrócone do pozycji zablokowanej.
   3. Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.
   4. Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym wodą destylowaną.
   5. Myj szkiełka 2x przez 2 min w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Ciągle mieszać.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Piekarnik HybEZ (110v)	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	Numer katalogowy: 321710
Stojak przesuwny HybEZ	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	300104
ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	310018
Odczynnik RNAscope H202 i Protease Plus	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	Numer katalogowy: 322330	Nadtlenek wodoru x2 i proteaza plus x 1
Odczynniki do odzyskiwania celu RNAscope	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	Numer katalogowy: 322000