Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału w hybrydyzacji RNA in situ: technika wykrywania określonych sekwencji RNA w skrawkach tkanek

Streszczenie

Źródło: Outh-Gauer, S. et al. Chromogeniczna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnozowania raka głowy i szyi związanego z HPV. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje strategię sekwencyjnej hybrydyzacji, która polega na hybrydyzacji sond mRNA do określonego docelowego mRNA. Po hybrydyzacji sondy przeprowadza się wzmocnienie sygnału w celu zwiększenia rozdzielczości poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu podczas RNA-CISH próbek histologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przeprowadzanie testu

UWAGA: Nie pozwól, aby sekcje wyschły pomiędzy etapami inkubacji.

1. Hybrydyzacja sondy HPV
   UWAGA: Upewnij się, że sondy są wstępnie ogrzane, aby rozpuścić wszelkie opady przed użyciem. Na tym etapie zamiast sondy HPV można również zastosować izomerazę peptydylo-prolilową B (PPIB) do kontroli pozytywnej lub reduktazę dihydrodipikolinianową (DAPB) do kontroli ujemnej (patrz tabela materiałów).
   1. Dotknij i/lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je w stojaku na slajdy. Dodaj ~ 4 krople sondy HPV, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.
   2. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 2 godziny w temperaturze 40 °C.
      UWAGA: Aby zapobiec parowaniu, upewnij się, że pokrętło jest całkowicie obrócone do pozycji zablokowanej.
   3. Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.
   4. Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.
   5. Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.
2. Hybrydyzacja AMP1, AMP2, AMP3 i AMP4
   UWAGA: Kroki te obejmują hybrydyzację w piecu do hybrydyzacji i AMP1–AMP4 z zakupionego zestawu (patrz Tabela materiałów).
   1. Dotknij i/lub przesuń, aby usunąć nadmiar płynu ze szkiełek i umieścić je w stojaku na slajdy. Dodaj ~4 krople AMP1, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.
   2. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 °C.
   3. Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny.
   4. Szkiełko po szkiełku szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.
   5. Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.
   6. Powtórz kroki 1.2.1–1.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP2 zamiast AMP1 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 minuty, za każdym razem w świeżym buforze do mycia.
   7. Powtórz kroki 1.2.1–1.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP3 zamiast AMP1 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 minuty, za każdym razem w buforze do świeżego płukania.
   8. Powtórz kroki 1.2.1–1.2.5, ale użyj ~4 kropli AMP4 zamiast AMP1 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Myj szkiełka 2x przez 2 minuty, za każdym razem w świeżym buforze do mycia.
3. Hybrydyzacja AMP5 i AMP6
   UWAGA: Te kroki nie obejmują hybrydyzacji w piekarniku, ale hybrydyzację w temperaturze pokojowej. AMP5 i AMP6 pochodzą z zakupionego zestawu (patrz Tabela materiałów).
   1. Dotknij i/lub przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je w stojaku na slajdy. Dodaj ~4 krople AMP5, aby całkowicie pokryć każdą sekcję.
   2. Przykryj tacę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Szkiełko po szkiełku, szybko usuń nadmiar płynu i umieść go w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia.
   4. Myć szkiełka w 1x buforze do mycia przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Powtórz to ze świeżym buforem do mycia 1x.
   5. Powtórz kroki 1.3.1–1.3.4, ale użyj ~4 kropli AMP6 zamiast AMP5 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka 2x przez 2 minuty, za każdym razem w buforze do świeżego mycia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Piekarnik HybEZ (110v)	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	Numer katalogowy: 321710
Stojak przesuwny HybEZ	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	300104
Odczynniki do wykrywania RNAscope 2.5 HD-BROWN	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	Numer katalogowy: 322310	Ten zestaw zawiera odczynniki do amplifikacji AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 i AMP6 oraz odczynniki do wykrywania DAB-A i DAB-B
Sonda kontroli ujemnej RNAscope 3-plex	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	320871	DAPB (Polskie Biuro Prasowe)
Sonda kontroli pozytywnej RNAscope 3-plex	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	320861	Protokół PPIB
Sonda RNAscope - HPV16/18	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	311121
Odczynniki buforowe do płukania RNAscope	Zaawansowana diagnostyka komórkowa Inc.	310091	Bufor do płukania 50X x4