1. Przygotowanie odczynników do barwienia przeciwbarwiącego
- Przygotuj 50% hematoksyliny.
- W dygestorium dodać 100 ml hematoksyliny Gilla I (patrz tabela materiałów) do 100 ml wody destylowanej w naczyniu barwiącym.
nuta: 50% roztwór do barwienia hematoksyliny może być ponownie używany przez okres do 1 tygodnia.
- Przygotować 0,02% (w/v) wody amoniakalnej (odczynnik do niebieszczenia).
- W dygestoriach dodać 1,43 ml wodorotlenku amonu 1 N do 250 ml wody destylowanej w butli miarowej lub innym pojemniku. Uszczelnij cylinder folią parafinową. Dobrze wymieszaj jego zawartość, aby uzyskać 3x–5x.
nuta: Do oznaczania ilościowego bardzo ważne jest użycie wodorotlenku amonu. Odczynniki mogą być przygotowane z wyprzedzeniem. Upewnij się, że wszystkie pojemniki pozostają przykryte.
2. Wykrywanie sygnału za pomocą 3,3'-diaminobenzydyny
UWAGA: Diaminobenzydyna (DAB) jest toksyczna. Postępuj zgodnie z odpowiednimi środkami ostrożności i wytycznymi bezpieczeństwa podczas utylizacji i obchodzenia się z tą substancją chemiczną.
- Wymieszać równe objętości DAB-A i DAB-B (patrz Tabela Materiałów) w probówce o odpowiedniej wielkości, dozując taką samą liczbę kropli każdego roztworu. Przygotuj ~120 μl substratu DAB na sekcję (~2 krople każdego odczynnika/łącznie 4). Dobrze wymieszaj 3x–5x.
- Wyjmij każde szkiełko, pojedynczo, ze stojaka na szkiełka i dotknij i/lub przesuń, aby usunąć nadmiar płynu przed umieszczeniem go w stojaku na szkiełka.
- Odpipetować ~120 μL DAB na każdy fragment tkanki. Upewnij się, że sekcje są przykryte i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Pozostałą część DAB należy zutylizować zgodnie z lokalnymi przepisami i włożyć szkiełko do stojaka na slajdy zanurzonego w naczyniu do barwienia wypełnionym wodą z kranu.
3. Przeciwbarwienie
- Przenieś ruszt do szkiełka do naczynia barwiącego zawierającego 50% roztworu barwiącego hematoksylinę, pozwól mu odpocząć przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Pamiętaj, że slajdy zmienią kolor na fioletowy.
- Natychmiast przenieś ruszt na szkiełka z powrotem do naczynia do barwienia zawierającego wodę z kranu i umyj szkiełka 3x–5x, przesuwając ruszt w górę iw dół.
- Powtarzaj etap mycia świeżą wodą z kranu, aż szkiełka będą czyste, a sekcje pozostaną fioletowe.
- Zastąp wodę z kranu w naczyniu do barwienia 0.02% wodą amoniakalną. Przesuwaj stelaż w górę i w dół 2x–3x. Zwróć uwagę, że sekcja tkanki powinna zmienić kolor na niebieski.
- Zastąp wodę amoniakalną wodą z kranu. Umyj szkiełka 3x–5x.
4. Odwodnienie
- Przenieś stojak na szkiełka do naczynia do barwienia zawierającego 70% etanolu w dygestoriach i pozostaw na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.
- Przenieś ruszt do szkiełka do pierwszego naczynia do barwienia zawierającego 100% etanolu i pozostaw go na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.
- Przenieś ruszt do szkiełka do drugiego naczynia do barwienia zawierającego 100% etanolu i pozostaw na 2 minuty z okazjonalnym mieszaniem.
- Przenieś ruszt do szkiełka do naczynia do barwienia zawierającego ksylen i pozwól mu odpocząć przez 5 minut, od czasu do czasu mieszając.
5. Montaż ślizgowy
- Wyjmij szkiełka ze stojaka na prowadnice i połóż je płasko, sekcjami skierowanymi do góry w dygestorium.
- Montuj po jednym szkiełku na raz, dodając 1 kroplę medium montażowego na bazie ksylenu do każdego szkiełka i ostrożnie umieszczając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na sekcji. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza.
- Suszyć szkiełka na powietrzu przez ≥5 min.
6. Ocena próbki
- Zbadaj skrawki tkanek pod standardowym mikroskopem jasnego pola w powiększeniu 20x–40x.
