Zbieranie DRG z kręgosłupa szczura: procedura ekstrakcji zwoju korzenia grzbietowego z kręgosłupa modelu szczura

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Schmidt, L. B. et al. Model in vivo błony kosmówkowo-omoczniowej piskląt do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie pokazujemy ekstrakcję zwoju korzenia grzbietowego lub DRG z pobranego kręgosłupa szczura do dalszych zastosowań.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zbiór i przygotowanie DRG (szacowany czas: 2 godziny, dzień 8)

UWAGA: Eksperymenty na myszach i szczurach wymagają zgody IACUC. W niektórych krajach stosowanie jaj kurzych wymaga również zezwolenia.

Zdobądź od sześciu do siedmiu tygodni szczurów Sprague Dawley (~200 g wagi), aby wydobyć DRGs.
nuta: Jeden szczur powinien dać ~ 40 DRG szyjki macicy i klatki piersiowej. Mysz DRG również integruje się z CAM; Jednak warunki dla tego gatunku muszą być optymalizowane niezależnie.
W komorze z przepływem laminarnym należy pobrać DRG z okolic szyjki macicy i klatki piersiowej zgodnie z protokołem ekstrakcji DRG myszy opublikowanym w innym miejscu. Postępuj zgodnie z rysunkiem 1, aby uzyskać orientację, jak zbierać DRG.
1. Poddaj szczura eutanazji przez nakłucie serca po podaniu ketaminy/ksylazyny wstrzykniętej dootrzewnowo. Oczyść skórę szczura 70% etanolem i usuń kręgosłup szczura za pomocą nożyczek. Nie należy wykonywać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ mogłoby to spowodować uszkodzenie DRG szyjki macicy.
2. Oddziel odcinek szyjny, piersiowy i lędźwiowy tymi samymi nożycami, postępując zgodnie ze schematyczną reprezentacją anatomiczną i ogólnymi obrazami przedstawionymi na rysunku 1A-D. Umieść sekcje kręgosłupa w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym z 1X PBS, aby utrzymać mokre tkanki.
3. Delikatnymi nożycami do kości otwórz kości kręgowe w części grzbietowej i brzusznej, oddzielając kręgosłup na dwie boczne połowy (ryc. 1E-F). Umieść skrawki tkanki w czystym 10-centymetrowym naczyniu ze świeżym 1X PBS.
4. Za pomocą kleszczy delikatnie odłącz rdzeń kręgowy od kości kręgów, aby uwidocznić DRG (ryc. 1G).
5. Cienkimi kleszczami trzymanymi pod każdym DRG chwyć go i wyciągnij z jamy kostnej, w której jest osadzony. Nie trzymaj DRG bezpośrednio, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanek. Nie przycinaj wiązek aksonów z DRG (Rysunek 1H).
  nuta: Unikaj stosowania DRG odcinka lędźwiowego, ponieważ mają one ograniczoną integrację z CAM. Aby uzyskać lokalizację regionu DRG, postępuj zgodnie ze schematyczną ilustracją i ogólnymi obrazami anatomicznymi na rysunku 1A-D.
Natychmiast po zbiorze umieść każdy DRG w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 2% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu DRG. Zgrupuj wszystkie DRG w tym samym naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm z 4 ml pożywki hodowlanej.
Po zebraniu wszystkich DRG przenieś je do nowego naczynia hodowlanego z pożywką hodowlaną DMEM uzupełnioną 2% Pen/Strep plus 10% FBS i zawierającą 1,25 μg/ml czerwonego barwnika fluorescencyjnego. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Ekstrakcja DRG w 8 dniu. A. Schemat szczura ilustrujący anatomiczne położenie kręgosłupa. B. Schemat konfiguracji kręgów szczura przedstawiający różne obszary ciała; zielony dla szyjki macicy, ciemnoniebieski dla klatki piersiowej, pomarańczowy dla odcinka lędźwiowego i jasnoniebieski dla kręgów krzyżowych. C-D. Brzuszny aspek...