Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Schmidt, L. B. et al. Model in vivo błony kosmówkowo-omoczniowej piskląt do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Szczepienie DRG na CAM (szacowany czas: 40 min, dzień 8)

1. Przygotuj 6 cm naczynie hodowlane z pożywką HBSS, aby umyć DRG przed implantacją. Przynieś przygotowane jaja do komory laminarnej do hodowli komórkowych. Usuń błonę parafinową z jajka (ryc. 1A).
2. Za pomocą cienkich sterylnych kleszczyków delikatnie chwyć jeden DRG z wnętrza pożywki hodowlanej. Zanurz go w pożywce HBSS, aby usunąć nadmiar podłoża zawierającego barwnik fluorescencyjny. Trzymaj DRG bardzo delikatnie; W przeciwnym razie przyklei się do kleszczy.
3. Umieść DRG na CAM, uważając, aby nie przebić membrany (Rysunek 1B-C). W razie potrzeby użyj innej pary kleszczy, aby pomóc odłączyć DRG od końcówki kleszczy podczas umieszczania go na CAM.
   nuta: Utrzymywanie DRG w stanie mokrym z podłożem HBSS ułatwi również oderwanie się od kleszczy.
4. Przykryj jajko sterylnym przezroczystym dressingiem foliowym. Zakryj wszystkie okienka i nakłucia wykonane w skorupce jajka, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego (rysunek 1D).
5. Po zaszczepieniu DRG we wszystkich jajach, jaja należy inkubować w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% przez 2 dni, bez rotacji.

2. Szczepienie komórek nowotworowych na CAM (szacowany czas: 1 h 30 min, dzień 10)

1. Po 48 godzinach przed szczepieniem komórek należy umieścić potrzebne komórki na płytkach hodowlanych. Oblicz 0,5 do 1 x 10⁶ komórek na jajo dla komórek UM-SCC-1 w celu wygenerowania trójwymiarowych guzów w CAM. Należy pamiętać, że liczba komórek może się różnić w zależności od linii komórkowej.
2. Odessać pożywkę i dodać pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnioną 1% Pen/Strep plus 10% FBS i 2,5 μg/ml zielonego barwnika fluorescencyjnego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie sprawdź intensywność fluorescencji pod mikroskopem, odessaj pożywkę, przemyj raz 1X PBS i dodaj 0,25% trypsyny na maksymalnie 10 minut. Zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki uzupełnionej DMEM.
3. Wirować przy 250 x g przez 4 minuty, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać pożywkę DMEM i ponownie zawiesić w HBSS, aby zmyć nadmiar barwnika fluorescencyjnego. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
4. Przynieś jaja do komory laminarnej do hodowli komórkowych. Za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz przezroczysty opatrunek foliowy, który przykrywa jajko (ryc. 1E-F).
5. Ponownie odwirować obliczoną liczbę komórek, odessać pożywkę HBSS i ponownie zawiesić do końcowego stężenia 0,5 do 1 x 10⁶ komórek na 5 μl tej samej pożywki (ryc. 1G). Przygotować ilość potrzebną do całkowitej liczby jaj (5 μl zawiesiny komórek na jajo).
6. Umieścić 5 μl roztworu komórkowego na CAM, około 2 mm od DRG (Rysunek 1H). Zachowaj jednakowe odległości między DRG a komórkami. Bądź bardzo ostrożny, aby nie naruszyć jaja, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się komórek.
   nuta: Aby rozpocząć implantację komórek, należy wybrać jaja, na których powierzchnia CAM jest wizualnie sucha. Jeśli powierzchnia jest zbyt mokra, komórki mogą się rozprzestrzeniać i nie tworzyć regularnych guzów.
7. Przykryj jajko nowym dressingiem filmowym, jak w kroku 1.4. Przeszczep komórki we wszystkich jajach. Jaja należy inkubować w inkubatorze nawilżającym w temperaturze 38 °C i wilgotności 54% przez 7 dni, bez rotacji.

Wyniki

Rycina 1: Szczepienie DRG, komórek i pobieranie CAM: W dniu 8: A. CAM łatwo zaobserwować po usunięciu membrany parafinowa. B-C. Za pomocą drobnych kleszczyków DRG umieszcza się na CAM. Jajo przykrywa się dressingiem foliowym i umieszcza w inkubatorze; Strzałki wskazują otwory, które są zakryte. W dniu 10: E-F. Opatrunek ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator do jaj	Cyfrowy sportowiec GQF	#1502	Inkubator do jaj wyposażony w automatyczny rotator, termostat cyfrowy, kontrolę temperatury i wilgotności
Frez do grawerowania	DREMEL	Numer katalogowy #108	Służy do wiercenia skorupki jajka
Bardzo cienkie kleszcze Graefe, zakrzywione	Narzędzia Precyzyjnej Nauki (FST)	#11151-10	Służy do szczepienia DRG do CAM w dniu 8 i do pobrania CAMtissue w dniu 17
Bardzo cienkie kleszcze Graefe, proste	Narzędzia Precyzyjnej Nauki (FST)	#11150-10	Służy do przeszczepiania DRG do CAM w dniu 8 i do pobierania tkanki CAM w dniu 17
Zapłodnione jaja Lohmann White Leghorn			Jaja zapłodnione we wczesnych dniach zapłodnienia, najlepiej w pierwszym dniu po zapłodnieniu. Jaja użyte w tym protokole pochodzą z fermy drobiu Uniwersytetu Stanowego Michigan.
Kleszcze filtracyjne	EMD Milipore	#XX6200006P	kleszcze używane do usuwania skorupki jajka
HBSS (1x)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy #14025-092	Zbilansowany roztwór soli Hanka
Membrana parafinowa	Folia laboratoryjna Parafilm	#PM-996	Służy do tymczasowego zakrywania otworów jajowych do czasu szczepienia DRG w 8 dniu
PBS (1x) pH 7,4	Gibco (firma Gibco)	#10010-023	sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Tegaderm Przezroczysty opatrunek foliowy	3 mln	#9505W	Sterylny, 6x7cm służy do zakrywania otworów jaj podczas inkubacji