Osadzanie sferoid 3D w kroplach żelu agarozowego: technika zachowywania sferoid do dalszej analizy

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Rolver, M. G. et al. Ocena żywotności i śmierci komórek w 3D sferoidalnych kulturach komórek nowotworowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje technikę osadzania sferoid 3D w kroplach żelu agarozowego w celu ich konserwacji. Wbudowane sferoidy 3D mogą być dalej wykorzystywane do dalszej analizy.

Protokół

1. Osadzanie sferoid 3D

Przygotuj żel agarozowy, w którym zanurzone są sferoidy (konieczne tylko przy pierwszym wykonywaniu protokołu)
1. Wymieszaj 1 g bakto-agaru z 50 ml ddH₂O.
2. Podgrzewaj powoli w kuchence mikrofalowej, aż bakto-agar się rozpuści i utworzy się jednorodny żel. Nie dopuścić do wrzenia żelu.
3. Utrzymuj bakto-agar w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
4. Przechowywać w temperaturze 4 °C pomiędzy eksperymentami.
Osadzanie sferoid
1. W dniu 1, dla każdego stanu, zbierz co najmniej 12 sferoid w probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Umyj raz 1 ml lodowatego 1X PBS.
3. Aby utrwalić sferoidy, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu.
  nuta: Obchodzenie się z paraformaldehydem powinno odbywać się pod wyciągiem.
4. Pozwól im inkubować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
5. W dniu 2 ostrożnie podgrzej żel agarozowy, umieszczając go w zlewce wypełnionej wodą w kuchence mikrofalowej. Upewnij się, że żel się nie zagotuje. Trzymaj ciepło na stołowej płycie grzewczej w temperaturze 60 °C do momentu użycia.
6. Umyj sferoidy dwukrotnie 1 ml lodowatego 1X PBS.
7. Odessać większość 1X PBS (pozostawienie około 100 μl w tym momencie jest praktyczne do obsługi sferoid).
8. Przygotuj pipetę o pojemności 20 μl, przecinając końcówkę pipety pod kątem, aby uzyskać bardziej spiczastą końcówkę z większym otworem (Rysunek 1).
  UWAGA: Następną część należy wykonać szybko, aby zapewnić optymalny transfer sferoidów i uniknąć zestalenia kropli żelu. Jeśli blok grzewczy nie jest dostępny, zaleca się najpierw złapanie sferoid, a następnie spowodowanie spadku agarozy (tj. zamiana kolejności punktów 1.2.9 i 1.2.10).
9. Zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko na ciepłym bloku grzewczym, aby zapobiec zestaleniu się agarozy.
10. Używając zmodyfikowanej końcówki pipety (krok 1.2.8), złap jak najwięcej sferoid w objętości 15–20 μl.
11. Ostrożnie wstrzyknąć 15–20 μl 1X PBS zawierającego sferoidę w środek kropli żelu agarozowego, nie dotykając szkiełka mikroskopowego.
  nuta: Jest to nieco trudna kwestia. Sferoidy zostaną utracone, jeśli końcówka pipety dotknie szkiełka mikroskopowego podczas wstrzykiwania sferoid do kropli żelu. Wskazane jest przećwiczenie całego procesu wytwarzania kropli agarozy i wstrzykiwania sferoid poprzez wstrzykiwanie kolorowego płynu do kropli. Umożliwi to wizualizację potencjalnej penetracji przez kroplę, ponieważ kolorowa ciecz będzie wyciekać na szkiełko.
12. Pozwól, aby kropla żelu agarozowego stwardniała, inkubując przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C. Gdy kropla żelu nieco zastygnie (ale nadal jest raczej miękka), ostrożnie wepchnij kroplę żelu ze szkiełka mikroskopowego do plastikowej kasety na chusteczki za pomocą skalpela.
13. Przykryj plastikowe kasety na chusteczki higieniczne 70% etanolem.
  nuta: W tym momencie sferoidy mogą być używane bezpośrednio lub przechowywane przez wiele miesięcy.
14. Sferoidę zatopioną w agarozie zanurzyć w parafinie, podzielić na szkiełka warstwowe o grubości 2–3 μm i wybarwić hematoksyliną i eozyną lub poddać barwieniu immunohistologicznemu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Mocowanie, osadzanie i analiza immunohistochemiczna sferoid. (A) Schematyczne przedstawienie protokołu osadzania sferoid. Poszczególne kroki są oznaczone jako (i-vii). (B) Obraz wbudowanej sferoidy MDA-MB-231. Podziałka skali: 50 μm. (C) Reprezentatywny obraz sferoidy MDA-MB-231 poddanej chemioterapii analizie...