$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej języka (TEM)
- Wykonuj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i usuń języki za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety.
- Zanurz języki w 75% etanolu na 3 minuty, a następnie włóż każdy język do probówki Eppendorfa (EP) o pojemności 1,5 ml z 1 ml 10 ml sterylnego roztworu buforowanego fosforanem (PBS).
nuta: Stężenie PBS we wszystkich kolejnych etapach jest takie samo jak stężenie na tym etapie.
- Liza komórek przez zamrażanie i rozmrażanie: Zamroź języki w probówkach EP w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, a następnie rozmrażaj języki w temperaturze pokojowej przez 45 minut przez 3 cykle.
- Załaduj każdy język na kawałek szwu chirurgicznego za pomocą igły chirurgicznej i owiń koniec szwu małym kawałkiem sterylnej folii aluminiowej. Operację należy wykonać w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm zawierającym 75% etanolu w sterylnych warunkach.
nuta: Odpowiednia długość każdego kawałka szwu chirurgicznego to około 20 cm, a odpowiedni rozmiar każdego kawałka folii aluminiowej to około 0,3cm2 (1 cm x 0,3 cm). Język powinien być załadowany w pobliżu folii aluminiowej.
- Opłucz każdy język 3 ml sterylnego PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm przez 30 sekund. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
- Umyj języki ultraczystą wodą: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnej ultraczystej wody do końcowego stężenia 90 μg/ml. Włóż języki do butelki zawierającej mieszadło. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
nuta: Do tej samej butelki można włożyć do 5 języków, biorąc pod uwagę splot szwu. Folia aluminiowa znajduje się na końcu szwu w butelce, aby zapobiec zsuwaniu się języka. Języki należy umieścić na wysokości 2 cm od dna butelki, regulując długość szwu pozostałego wewnątrz butelki. Ta uwaga dotyczy również kroków 1.8, 1.10, 1.12 i 1.16.
- Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 12 godzin.
- Umyj języki za pomocą NaCl: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 1 M NaCl do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
- Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
- Liza komórek za pomocą Triton X-100: Dodaj ampicylinę do końcowego stężenia 90 μg/ml do butelki z szerokim otworem zawierającej 250 ml sterylnego 2% Triton X-100 w PBS. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
- Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 48 godzin.
- Umyj języki za pomocą CaCl2/MgCl2: Dodaj ampicylinę do butelki z szeroką szyjką z 250 ml sterylnego 5 mM CaCl2/MgCl2 do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
- Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
- Trawienie przez DNazę: Dodaj 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do każdej probówki EP. Dodać odpowiednio DNazę do HBSS do końcowego stężenia 300 μM. Przesunąć każdy język do każdej probówki EP, tak aby część szwu znajdowała się na zewnątrz probówki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
nuta: Upewnij się, że część szwu, która pozostaje wewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również wewnątrz rurki EP w tym kroku i upewnij się, że część szwu, która pozostaje na zewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również poza rurką EP w tym kroku.
- Inkubować języki w probówkach EP w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Umyj języki za pomocą PBS: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego PBS do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
- Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
- Przygotowany TEM należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu użycia.