Kriomielenie tkanki pozbawionej komórek: technika uzyskiwania drobnego proszku macierzy zewnątrzkomórkowej

Streszczenie

Źródło: Kornmuller, A. et al. Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako platform do hodowli i dostarczania komórek specyficznych dla tkanki. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie prezentujemy protokół uzyskiwania drobno zmielonego proszku macierzy zewnątrzkomórkowej z liofilizowanej tkanki bezkomórkowej metodą kriomielenia. Sproszkowany ECM zachowuje swój skład biochemiczny i może być stosowany do syntezy mikronośników.

Protokół

1. Przetwarzanie tkanek bezkomórkowych

1. Decelularyzacja i liofilizacja
   1. Decelularyzacja tkanek będących przedmiotem zainteresowania zgodnie z ustalonym protokołem.
      nuta: Rusztowania w niniejszym badaniu zostały przygotowane zgodnie z opublikowanymi protokołami decelularyzacji dla ludzkiego DAT, świńskiego DDT i świńskiego DLV. Dostępny na rynku, nierozpuszczalny kolagen może być również używany do wytwarzania pianek i mikronośników, takich jak kolagen pozyskiwany ze ścięgien bydlęcych, który jest z powodzeniem stosowany w zakresie stężeń 10-50 mg / ml. Inne nierozpuszczalne źródła kolagenu mogą być wykorzystywane, ale mogą wymagać optymalizacji w celu zidentyfikowania zakresu stężeń, który zapewni stabilne rusztowania.
   2. Przenieś uwodnioną tkankę pozbawioną komórek lub oczyszczony kolagen do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą kleszczyków i dodaj wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody (ddH₂O), aby zanurzyć tkankę, do maksymalnej całkowitej objętości 35 ml.
   3. Zamrażać próbkę przez noc w temperaturze -80 °C, z probówką wirówkową ustawioną poziomo podczas zamrażania, aby zmaksymalizować powierzchnię do sublimacji podczas późniejszej liofilizacji.
   4. Zdjąć nakrętkę z probówki wirówkowej i przenieść zamrożoną próbkę do słoika do liofilizacji.
   5. Liofilizować próbkę za pomocą liofilizatora laboratoryjnego przez 48–72 godzin lub do całkowitego wyschnięcia.
      nuta: Czas schnięcia może się różnić dla różnych liofilizatorów i tkanek bezkomórkowych.
   6. Drobno zmielić liofilizowany ECM na małe kawałki (~ 1–2 mm³) za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych.
   7. Przechowywać rozdrobniony ECM w eksykatorze do czasu, gdy będzie gotowy do dalszej obróbki.
      nuta: Zaleca się natychmiastowe użycie rozdrobnionego ECM, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci z otoczenia.
2. Kriomielenie (opcjonalnie do produkcji pianki)
   1. Napełnij komorę mielenia ze stali nierdzewnej o pojemności 25 ml do laboratoryjnego młyna kulowego mielonym liofilizowanym ECM i dodaj dwie kule mielące ze stali nierdzewnej o średnicy 10 mm.
   2. Zamknij i całkowicie zanurz załadowaną komorę mielenia w ciekłym azocie na 3 minuty.
   3. Mielić zamrożoną próbkę przez 3 minuty przy 30 Hz (1 800 obr./min).
   4. Powtarzać czynności 1.2.2 i 1.2.3, aż ECM zostanie zmielony na drobny proszek.
      nuta: Liczba powtórzeń tych kroków może się różnić w zależności od źródła ECM. Na przykład DAT zazwyczaj wymaga 3 cykli mielenia, aby wytworzyć drobny proszek.
   5. Przenieść proszek za pomocą czerpaka do szklanej fiolki, szczelnie zamknąć i przechowywać w eksykatorze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewody z zaciskiem krokodylkowym	Firma VWR	Numer telefonu 470149-728
Folia aluminiowa	Fisher Naukowy	01-213-101
Waga analityczna	Sartorius Sartorius (Wyspa	CPA225D
System kriomielenia	Retsch powiedział:	20.745.0001	Zobacz materiał MM 400
Eksykator	Fisher Naukowy	8624426	Do liofilizowanego ECM i przechowywania na biorusztowaniu
Kolba Dewara	Fisher Naukowy	10-196-6	Niska forma; zakres objętości 250 - 500 ml
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)			Z systemu oczyszczania wody Barnstead GenPure xCAD
ECM (macierz zewnątrzkomórkowa)			Wyizolowany z ludzkiej tkanki tłuszczowej, skóry właściwej świni lub mięśnia sercowego świni, zgodnie z opisem w Flynn i wsp. 2010, Reing i wsp. 2010 oraz Wainwright i wsp. 2010
Kleszcze	Firma VWR	Nr tel. 37-501-32	Do przenoszenia pianek
Zamrażarka (-20 °C)	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-346
Zamrażarka ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Szklane fiolki	Fisher Naukowy	03-339-26D	Do przechowywania liofilizowanego, kriofrezowanego ECM
Ciekły azot			Do natryskiwania elektrycznego
Liofilizator	Labconco	7750021	Strefa wolna4.5
Komora mielenia	Retsch powiedział:	Numer katalogowy 02.462.0213	Zalecana objętość 25 ml
Kule mielące	Firma VWR	Numer katalogowy 16003-606	Średnica 10 mm, zalecana stal nierdzewna
Penicylina-streptomycyna	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122	Używany do mediów proliferacyjnych
PD Pipet-Aid	Mandel Naukowy	DRU-4-000-101
Ściąga	Firma VWR	89259-968	Do zbierania mikronośników
Nożyczki chirurgiczne	Firma VWR	Numer katalogowy: 82027-590