Wytwarzanie pianki pochodzącej z macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez liofilizację: procedura generowania rusztowań biologicznych z ECM tkanek zdecelularyzowanych

Streszczenie

Źródło: Kornmuller, A. et al. Produkcja pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako platform do hodowli i dostarczania komórek specyficznych dla tkanki. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje metodę syntezy czystych pianek pochodzących z ECM bez potrzeby chemicznego sieciowania. Te pianki pochodzące z ECM znajdują zastosowanie jako zaawansowane modele hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Protokół

1. Produkcja pianki wywodzącej się z ECM

1. Przygotować jednorodną zawiesinę ECM przez rozproszenie drobnego proszku ECM w roztworze buforowym i inkubować w temperaturze 37 °C z ciągłym mieszaniem przy 120 obr./min, aż zawiesina będzie ciepła.
2. Rozcieńczyć zawiesinę ECM w 0,2 M kwasie octowym do pożądanego stężenia.
   nuta: W zależności od źródła ECM, stabilne piany mogą być przygotowywane w zakresie 10–100 mg/ml, przy czym zalecanym zakresem dla DAT, DDT i DLV jest 15–50 mg/ml. Zazwyczaj pianki wytwarzane w wyższych stężeniach będą nieco mniej porowate, ale bardziej stabilne w kulturze i łatwiejsze w obsłudze.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 18G, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w zawiesinie ECM, napełnij żądaną formę zawiesiną ECM. Aby wytworzyć pianki DAT, DDT i DLV, należy dozować 400 μl zawiesiny ECM 35 mg/ml do 48-dołkowej płytki poddanej działaniu hodowli komórkowej.
   nuta: Kształt wybranej formy i objętość zawiesiny ECM będą determinować geometrię powstałej pianki.
4. Przykryj i zamroź foremki na noc, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C.
   nuta: Temperatura zamarzania może wpływać na porowatość pianek. Większe pory są oczekiwane, gdy próbki są zamrażane w temperaturze -20 °C w porównaniu do -80 °C ze względu na tworzenie się większych kryształków lodu. Aby wytworzyć pianki o jednolitej porowatej strukturze, upewnij się, że forma nie styka się z powierzchnią przewodzącą, aby zapobiec kierunkowemu chłodzeniu.
5. Umieścić foremki zawierające zamrożone próbki w kolbie liofilizatora. Podłączyć kolbę liofilizatora do laboratoryjnego systemu liofilizatora i suszyć przez 24 godziny
   UWAGA: Ważne jest, aby próbka pozostała zamrożona przed liofilizacją.
6. Przechowuj liofilizowane pianki w eksykatorze do czasu, gdy będą potrzebne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Waga analityczna	Sartorius Sartorius (Wyspa	CPA225D
Probówki wirówkowe (15 ml)	Sarstedt	Numer katalogowy: 62.554.205
Probówki wirówkowe (50 ml)	Sarstedt	62.547.205
Kolagen z bydlęcego ścięgna achilles ścięgno (nierozpuszczalne)	Sigma	Zobacz materiał C9879	Lub podobny nierozpuszczalny kolagen źródło; Może być używany jako Alternatywa dla Decellularized chusteczki do produkcji pianek i Mikronośniki
Eksykator	Fisher Naukowy	8624426	Do liofilizowanych ECM i Przechowywanie biorusztowań
Kolba Dewara	Fisher Naukowy	10-196-6	Niska forma; zakres objętości 250 -500 ml
Woda podwójnie destylowana (ddH_{2} O)			Z Barnstead GenPure xCAD System oczyszczania wody
D-PBS (buforowany fosforanami sól fizjologiczna)	żubr	311425125
ECM (macierz zewnątrzkomórkowa)			Izolowany od ludzkiej tkanki tłuszczowej tkanka, skóra właściwa świni lub świnia mięśnia sercowego, zgodnie z opisem w Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, oraz Wainwright i in. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Kleszcze	Firma VWR	Nr tel. 37-501-32	Do przenoszenia pianek
Zamrażarka (-20 °C)	Firma VWR	Numer katalogowy: 97043-346
Zamrażarka ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Szklane fiolki	Fisher Naukowy	03-339-26D	Do przechowywania liofilizowanego kriomielonego Ecm
Ciekły azot			Do natryskiwania elektrycznego
Liofilizator	Labconco	7750021	Strefa wolna4.5
Igła 18 G	Firma VWR	C ABD305185	Do dozowania zawiesiny ECM do form
Wytrząsarka z inkubatorem orbitalnym	SciLogex	832010089999	Kontrolowana temperatura (37 °C)
Pipety serologiczne (10 ml)	Sarstedt	Numer katalogowy: 86.1254.001
Pipety serologiczne (25 ml)	Sarstedt	Numer katalogowy: 86.1685.001
chlorek sodu	Sklep BioShop	7647-14-5
Sodu fosforan jednozasadowy	Sklep BioShop	Numer katalogowy: 10049-21-5

Sar powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: