Wytwarzanie rusztowań biologicznych przez elektronatryskiwanie: technika generowania rusztowań mikronośnikowych pochodzących z zewnątrzkomórkowej macierzy tkanki pozbawionej komórek

Streszczenie

Źródło: Kornmuller, A. et al. Produkcja pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako platform hodowli i dostarczania komórek specyficznych dla tkanki. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje procedurę wytwarzania mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą elektrorozpylania. Te mikronośniki symulują natywne mikrośrodowisko specyficzne dla tkanek i są stabilne w długoterminowych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro.

Protokół

1. Wytwarzanie mikronośników pochodzących z ECM za pomocą elektronatryskiwania

UWAGA: Przegląd konfiguracji elektronatryskiwania jest pokazany na rysunku 1.

1. Inkubować wcześniej przygotowaną kriofrezowaną zawiesinę ECM w temperaturze 37 °C z ciągłym mieszaniem przy 100 obr./min O/N.
   nuta: Kriofrezowany ECM służy do wytwarzania mikronośników pochodzących z ECM, aby zapewnić większą jednorodność zawiesiny i zapobiec zatykaniu się podczas elektronatryskiwania.
2. Załadować 3 ml zawiesiny ECM do strzykawki Luer-Lock o pojemności 3 ml i umieścić skrzydełkowy zestaw infuzyjny na otworze strzykawki.
   nuta: Można stosować różne grubości igieł, uznając, że wybór może mieć wpływ na rozmiar i kształt powstałych mikronośników. Aby wytworzyć mikronośniki DAT, DDT i DLV, użyj igły 25G.
3. Zabezpieczyć strzykawkę w pompie strzykawkowej. Przymocuj igłę do stojaka na retortę i umieść końcówkę igły pionowo w odległości 4–6 cm od górnej części niskiej kolby Dewara (zalecany zakres wielkości 250–500 ml).
4. Przymocuj elektrodę zacisku krokodylkowego do końcówki igły i podłącz ją do dodatniego zacisku zasilacza wysokiego napięcia.
5. Złóż pasek folii aluminiowej (12 x 5 cm) na krawędzi kolby.
6. Przymocuj drugą elektrodę zacisku krokodylkowego do zewnętrznej krawędzi folii i podłącz ją do zacisku źródła uziemienia zasilacza.
7. Napełnij kolbę Dewara ciekłym azotem na około 1 cm od góry, tak aby 3/4 folii było zanurzone.
   nuta: Ważne jest, aby kolba Dewara była wypełniona ciekłym azotem. Powierzchnia ciekłego azotu nie może znajdować się mniej niż 2 cm od górnej krawędzi kolby podczas procesu elektronatryskiwania. Ciągłe uzupełnianie ciekłego azotu jest wymagane do utrzymania stałego poziomu podczas elektrorozpylania.
8. Ustawić pompę strzykawkową na szybkość infuzji 30 ml/h.
   nuta: Zmiana szybkości infuzji może zmienić kształt i średnicę mikronośnika, ale zalecany zakres to 25–35 ml/h. Chociaż jest to w dużym stopniu zależne od lepkości zawiesiny, natężenie przepływu poniżej 25 ml/h może powodować powstawanie większych mikronośników. Przy bardzo niskich natężeniach przepływu wielkość i kształt mikronośników mogą stać się mniej jednorodne. Przy szybkościach infuzji powyżej 35 ml/h jednorodność kropelek wytwarzanych w wyniku rozpylania elektrycznego może zostać zakłócona, co skutkuje powstawaniem niesferycznych mikronośników o szerszym rozkładzie wielkości.
9. Przyłóż napięcie 20 kV i włącz pompę strzykawkową, aby rozpocząć elektronatryskiwanie.
   nuta: Napięcie może być zmieniane w celu dostrojenia rozmiaru mikronośników i ma większy wpływ na średnicę niż szybkość infuzji. Zalecany zakres napięcia to 15–25 kV. Wraz ze wzrostem napięcia spodziewany jest spadek średnicy mikronośnika.
10. Po zakończeniu infuzji ostrożnie wylej nadmiar ciekłego azotu z Dewara, pozostawiając mikronośniki zawieszone w ~ 25 ml ciekłego azotu, aby upewnić się, że pozostaną zamrożone.
11. Natychmiast przenieś mikronośniki z ciekłym azotem do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, wlewając jednym płynnym ruchem. Zebrać wszystkie zamrożone mikronośniki pozostałe w Dewarze za pomocą czerpaka i dodać je do probówki wirówkowej.
    nuta: W zależności od wielkości dewara, mikronośniki w ciekłym azocie można początkowo przelać do średniej wielkości naczynia, a następnie natychmiast przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
12. Przykryj probówkę wirówkową zawierającą mikronośniki ciekłym azotem folią aluminiową perforowaną z małymi otworami w ramach przygotowań do liofilizacji.
13. Umieścić zakryte probówki wirówkowe w kolbie liofilizatora. Natychmiast podłączyć kolbę do liofilizatora i wysuszyć próbki O/N.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby mikronośniki były zawieszone w ciekłym azocie, aby upewnić się, że nie rozmrozą się przed tym etapem, ponieważ rozmrażanie może spowodować zapadnięcie się i/lub agregację. Mikronośniki DAT, DDT i DLV wytwarzane w stężeniu 35 mg/ml przy użyciu opisanych powyżej warunków elektronatryskiwania będą zazwyczaj miały średnicę uwodnionego w zakresie od 350 do 500 μm. Rozkład wielkości może się różnić w zależności od źródła ECM.
14. Przechowywać liofilizowane mikronośniki w eksykatorze do czasu, gdy będą potrzebne.

Wyniki

Rysunek 1. Przegląd aparatury do elektronatryskiwania stosowanej w produkcji mikronośników. A: Obraz przedstawiający rozmieszczenie kluczowych urządzeń do elektronatryskiwania, w tym pompy strzykawkowej i zasilacza wysokiego napięcia, a także położenie igły względem Dewara ciekłego azotu. B: Schemat elektronatryskiwania, w tym zalecane zakresy napięcia, szybkość infuzji,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewody z zaciskiem krokodylkowym	Firma VWR	Numer telefonu 470149-728
Folia aluminiowa	Fisher Naukowy	01-213-101
Probówki wirówkowe (15 ml)	Sarstedt	Numer katalogowy: 62.554.205
Probówki wirówkowe (50 ml)	Sarstedt	62.547.205
Eksykator	Fisher Naukowy	8624426	Do liofilizowanego ECM i przechowywania na biorusztowaniu
Kolba Dewara	Fisher Naukowy	10-196-6	Niska forma; zakres objętości 250 - 500 ml
ECM (macierz zewnątrzkomórkowa)			Wyizolowany z ludzkiej tkanki tłuszczowej, skóry właściwej świni lub mięśnia sercowego świni, zgodnie z opisem w Flynn i wsp. 2010, Reing i wsp. 2010 oraz Wainwright i wsp. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ciekły azot			Do natryskiwania elektrycznego
Liofilizator	Labconco	7750021	Strefa wolna4.5
Wytrząsarka z inkubatorem orbitalnym	SciLogex	8.3201E+11	Kontrolowana temperatura (37 °C)
Stojak na retorty	Firma VWR	Numer telefonu 470019-526
Zacisk stojaka do retorty	Firma VWR	Numer katalogowy 21573-606
Strzykawka Safety-Lok	Bd	309606	Strzykawka Luer lock 3 ml do wytwarzania mikronośników i dozowania zawiesiny ECM
Ściąga	Firma VWR	89259-968	Do zbierania mikronośników
Pompa strzykawkowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 10117-490	Sterowany mikroprocesorem
Zasilacz wysokonapięciowy	Badania wysokiego napięcia gamma	ES30P-5W/DDPM	Możliwość pracy w zalecanym zakresie napięcia 15 - 25 kV
Zestaw do infuzji Winged	Terumo (Ziemia)	22258092	Długość rurki 30 cm, zalecane 25 G 3/4"; Można stosować inne rozstawy igieł, które mogą wpływać na średnicę mikronośnika