Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie półstałych kropelek matrycy (< 1 min na płytkę)
- Umieść wstępnie schłodzoną szklaną płytkę denną na bloku lodu pod mikroskopem operacyjnym. Upewnij się, że podwielokrotność matrycy pozostaje na lodzie przez cały czas.
- Umieścić kroplę matrycy o wielkości 1,5 μl w każdym z czterech rogów płytki ze szklanym dnem za pomocą mikropipetera o pojemności 2 μl lub 10 μl, pozostawiając odległość co najmniej równą samej kropli od krawędzi szklanej studzienki.
- Umieść końcówkę pipety bezpośrednio na szkle pod kątem 45 stopni. Powoli odpipetować matrycę. Powoli odsuń się od szklanego dna po zaciśnięciu matrycy na płycie.
nuta: Napięcie powierzchniowe między matrycą a szkłem powinno za każdym razem tworzyć idealną półkulę.
- Należy przerwać pipetowanie tuż przed opróżnieniem końcówki, ponieważ przypadkowe wstrzyknięcie powietrza do kropli matrycy powoduje znacznie większą średnicę kropli matrycy i jest trudne do usunięcia.
nuta: Użycie drugiej wskazówki do ustabilizowania wskazówki pipetującej ułatwia dokładniejsze umieszczenie.
2. Wprowadzenie DRG do półstałych kropel matrycy (< 2 min na płytkę)
- Płytkę z kropelkami matrycy pozostawić na krótko w temperaturze pokojowej (~1 min). To nieznacznie usztywnia matrycę, ułatwiając precyzyjne umieszczenie DRG.
- Delikatnie zgarnij (nie chwytaj) DRG za pomocą zamkniętych mikroskopijnych kleszczy w lewej ręce. Ponownie ciemne tło na małym, białym DRG ułatwia wizualizację. Przenieść DRG na końcówkę igły 21G w prawej ręce. Ten transfer pozostawi resztki pożywki na kleszczach.
- Delikatnie wprowadzić DRG do środka kropli matrycy za pomocą igły 21G (Rysunek 1). W większości przypadków DRG łatwo uwalnia się do matrycy, a następnie można go ustawić centralnie za pomocą igły.
- Jeśli DRG przyklei się do igły, użyj mikroskopijnych kleszczyków, aby zepchnąć DRG z igły do kropli matrycy. Usuń nadmiar pożywki z mikroskopijnych kleszczyków za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
nuta: Wprowadzenie pożywki do matrycy zmieni średnicę, objętość i konsystencję testu. Blok lodu z kolorowym lub kolorowym napisem zapewnia kontrast tła, co ułatwia wizualizację tego delikatnego procesu.
- Po tym, jak płytka ma wszystkie cztery DRG, przeprowadź końcową kontrolę, aby upewnić się, że DRG znajduje się w środku kropli matrycy. W razie potrzeby dokonać regulacji za pomocą igły 21G.
- Przenieść gotową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Spowoduje to zestalenie matrycy półstałej i utrwalenie DRG na miejscu.
- Powtórzyć ten proces dla wszystkich DRG. Umieścić puste kropelki matrycy bez DRG jako kontrolę ujemną.
- Dodać 4 ml DMEM z 10% pożywką FBS do każdej płytki ze szklanym dnem po wypełnieniu wszystkich płytek i wystawieniu ich w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 3 minuty. Umieścić płytkę pod niewielkim kątem i powoli dodawać pożywkę, tak aby stopniowo stykała się z jednostkami matrycy-DRG.
nuta: Jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko lub energicznie, matryca i/lub DRG mogą ulec przemieszczeniu.
- Przechowywać testy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez następne 48–72 h.
nuta: Okresowe badanie testów wykaże obwodowy rozrost neurytów w kierunku krawędzi macierzy (ryc. 2). Gdy neuryty znajdują się na więcej niż trzech czwartych drogi do macierzy, właściwe jest płytki komórek.
3. Przygotowanie komórek raka głowy i szyi
UWAGA: Linie komórkowe inne niż komórki raka płaskonabłonkowego głowy i szyi mogą być użyte w tym eksperymentalnym projekcie.
- Utrzymuj linie komórkowe raka płaskonabłonkowego w DMEM z 10% FBS w preferowanych kolbach lub szalkach hodowlanych w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Aby przygotować komórki do eksperymentów, należy odessać całą pożywkę z kolby hodowlanej lub naczynia i umyć je dwukrotnie PBS. Zawieś komórki, dodając odpowiednią ilość 0,025% trypsyny na 5 minut, a następnie DMEM z 10% FBS. Odpipetować 4 ml mieszaniny komórek i pożywki do 6 ml szalek hodowlanych.
nuta: Płytka hodowlana o pojemności 6 ml zapewnia więcej niż wystarczającą ilość komórek, nawet jeśli zlewa się mniej niż 50%.
- Wystaw linie komórkowe HNSCC na różne warunki 24 godziny przed barwieniem i posiewem w teście DRG. Ponownie dozuj warunek po posianiu komórek, aby utrzymać spójne środowisko.
nuta: Dodaj przeciwciała, czynniki wzrostu, cytokiny lub inne cząsteczki do szalek z hodowlą komórkową 1-2 dni po rozebraniu myszy i wszczepieniu DRG do matrycy.
- Dodać fluorescencyjne barwienie komórek na 1 godzinę przed posiewem komórek (2-3 dni po pobraniu DRG i implantacji w matrycy).
nuta: Poszczególne zastosowane tutaj barwniki swobodnie przechodzą przez błonę komórkową; Jednak po reakcji z wewnątrzkomórkowymi grupami tiolowymi barwnik pozostaje w komórce i jest przekazywany do komórek potomnych. Barwienie znacznie ułatwia wizualizację w testach. Te tymczasowe plamy są idealne do tych testów, ponieważ fluorescencja jest obecna przez 2-3 dni, co jest ramą czasową tych eksperymentów. Pozwala również na użycie wielu różnych kolorów i eliminuje potrzebę tworzenia linii komórkowych transfekowanych białkami fluorescencyjnymi.
- Przygotuj 10 μM roztworu barwnika, mieszając 2 μL 10 mM barwników komórek podstawowych w 2 ml DMEM bez surowicy dla każdego stanu komórek. Podgrzej go do 37 °C przed dodaniem do komórek.
- Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki o pojemności 6 ml, pozostawiając przylegające komórki HNSCC na płytce. Dodać 2 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i usunąć 2 ml barwnika 10 μM komórek/DMEM bez surowicy dodanego do każdej płytki.
- Umieścić 6 ml płytki hodowlanej z wybarwieniem komórek do inkubatora o temperaturze 37 °C na 40 minut.
- Po 40 minutach odessać pożywkę. Dodaj 2 ml PBS, a następnie odessać. Dodać 1 ml 0,025% trypsyny do każdej płytki i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Po 3–5 minutach dodać 2 ml DMEM z 10% FBS i przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zakręć komórki i zawieś je ponownie w 1 ml DMEM z 10% FBS.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, a następnie dodaj DMEM z 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 300 000 komórek na ml.
4. Posiewanie komórek raka głowy i szyi
- Wyjąć z inkubatora płytki ze szklanym dnem z testami matrycowymi-DRG.
nuta: Ponownie, są one odpowiednie, gdy neuryty znajdują się co najmniej w 75% drogi do krawędzi macierzy, co zwykle następuje po 2-3 dniach. Najlepiej widać to przy użyciu obiektywu o powiększeniu co najmniej 10x.
- Zassać pożywkę do płytki ze szklanym dnem. Całkowicie zassać pożywkę w szklanej studzience bez wyjmowania jednostek matrycy-DRG.
- Pobrać 200 μl z 300 000 komórek/ml podłoża za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Umieść dwie krople komórek na każdym teście matrycowym-DRG. Wykonaj ten krok dla każdej kropli matrycy, tworząc cztery powtórzenia każdego warunku komórki na jednej płytce.
nuta: Półkulisty kształt matrycy pozwala komórkom osiąść w pierścieniu wzdłuż obwodu testu (ryc. 3a, ryc. 3b). Znalezienie pipety z płynnie działającym spustem znacznie ułatwia umieszczanie jednolitych kropli.
- Potwierdź podobną liczbę komórek i rozkład różnych warunków komórkowych pod mikroskopią 4X.
- Umieścić płytki ze szklanym dnem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na około 60 minut.
nuta: Chociaż objętość komórek i pożywek jest niewielka (~150 μL), testy nie wysychają, dopóki nie upłynie kilka godzin inkubatora.
- Po 60 minutach delikatnie dodaj 4 ml DMEM z 10% FBS wzdłuż bocznej ścianki szklanej płytki.
nuta: Z biegiem czasu komórki częściowo przylegają do dna płytki, a sposób dodawania pożywki nie narusza komórek. Różne typy komórek mogą potrzebować więcej lub mniej czasu, aby zacząć przylegać do płytki ze szklanym dnem.
- W tym czasie należy wymienić wszelkie leki egzogenne lub czynniki wzrostu, aby utrzymać poprzednie poziomy stężenia.
- Umieścić próbki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, z wyjątkiem sytuacji, gdy są one badane pod mikroskopem. Określ ilościowo wyniki tego testu za pomocą obrazowania mikroskopowego. Pokrótce policz pasma inwazji okołonerwowej w czterech kwadrantach, korzystając z 4-krotnego obrazu mikroskopowego.
nuta: Mikroskop z obiektywem 4X i możliwościami fluorescencji jest wystarczający do fotograficznego dokumentowania testów. Rozmiar testów dobrze mieści się w polu obiektywu 4X, który jest wystarczająco szczegółowy, aby uchwycić poszczególne obszary inwazji okołonerwowej. Inwazja okołonerwowa staje się widoczna w ciągu 24 godzin, ale po 48 godzinach integralność testów zaczyna słabnąć, ponieważ komórki nowotworowe dzielą się wzdłuż obwodu macierzy i atakują. Po upływie 48 godzin następuje również znaczny wypływ fibroblastów z DRG, który zasłania wizualizację za pomocą mikroskopii jasnego pola. Dlatego zaleca się fotodokumentowanie wyników za pomocą mikroskopu 4X co najmniej dwa razy w tym oknie (np. po 24 i 48 godzinach od posiewu komórek nowotworowych). Należy pamiętać, że są to testy trójwymiarowe i trudno jest w pełni zobrazować cały test. Większość inwazji okołonerwowej zachodzi w płaszczyźnie od dołu płytki, gdzie komórki są osadzone w macierzy nieco powyżej dna płytki. Ponieważ płaszczyzna ta jest zbliżona do poziomej, zdecydowana większość neurytów z komórkami nowotworowymi jest rejestrowana na jednopoziomowym obrazie przy 4X.
