Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Streszczenie

Źródło: Gilormini, M. et al. Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o cechach komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie opisujemy izolację subpopulacji komórek macierzystych nowotworowych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS. Wyizolowaną populację boczną komórek można wykorzystać do dalszej analizy.

Protokół

1. Wybór populacji bocznej (SP) za pomocą testu Hoechst Dye Efflux

1. Barwienie 50 milionów komórek barwnikiem Hoechst 33342
   1. Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 15 ml ze stożkowym dnem: jedną probówkę oznaczoną "Hoechst", a drugą oznaczoną "Hoechst i Werapamil". Przygotuj 10 ml 5 ml roztworu chlorowodorku werapamilu w sterylnej wodzie. Przygotuj pożywkę hodowlaną (CM) dla komórek macierzystych.
      1. Aby przygotować CM dla CSC (CM-CSC), połącz następujące elementy: zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco: F12 (1:3, v:v), 5% płodu cielęcego surowicy (FCS), 0,04 mg/l hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny, 0,1 g/l streptomycyny i 20 μg/l naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR).
   2. Pod okapem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć podłoże, przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,5 g/l) do kolby o powierzchni 75 cm². Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, dodając pożywkę używaną dla rodzicielskiej linii komórkowej. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
      1. Aby przygotować CM dla rodzicielskiej linii komórkowej (CM-P), należy uzupełnić DMEM 10% FCS, 0,4 mg/L hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/L streptomycyny).
   3. Rozcieńczyć zawiesinę komórek otrzymaną w kroku 1.1.2, aby otrzymać 10-7 komórek/ml w CM-P. Podziel zawiesinę komórek w dwóch przygotowanych probówkach: umieść 100 μl (10⁶ komórek) w probówce "Hoechst i Verapamil" i 4 ml (4 x 10⁷ komórek) w probówce "Hoechst".
   4. Do próbki "Hoechst i Werapamil" dodać 10 μl 5 mM roztworu chlorowodorku werapamilu (stężenie końcowe: 0,5 mM) i delikatnie wymieszać. Dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechsta (stężenie końcowe: 0,1 g/l). Do próbki "Hoechst" dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechst na 10-6 komórek (łącznie 200 μl). Odtąd należy chronić próbki przed bezpośrednim narażeniem na działanie światła za pomocą folii aluminiowej.
   5. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 h 30 min. Mieszać delikatnie co 15 minut, aby zapobiec osadzaniu się komórek.
   6. Probówki wirówkowe o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę z 2 ml 1x PBS.
   7. Probówki wirować o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad "Hoechst i Werapamil" w 500 μl jodku propidyny (PI) o stężeniu 5 mg/l rozcieńczonego w buforze PBS, a osad "Hoechst" w 4 ml roztworu 5 mg/l PI rozcieńczonego w buforze PBS.
   8. Przenieść roztwory próbek przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm w celu usunięcia agregatów i zebrania pojedynczych komórek w probówkach w celu pobrania próbki na cytometr przepływowy. Próbki należy przechowywać na lodzie i chronić przed bezpośrednim nasłonecznieniem za pomocą folii aluminiowej.

2. Izolacja populacji bocznej z wyłączeniem barwnika Hoechst przez sortowanie komórek

1. Przeprowadzić ujemną separację komórek Hoechsta na sortowniku cytometrii przepływowej o następujących parametrach: laser UV (355 nm), dwa detektory na ścieżce lasera UV z niebieskimi filtrami Hoechsta (450/50 BP) i czerwonym filtrem Hoechsta (610/20 BP) oraz dwa kolektory.
   1. Najpierw przeanalizuj próbkę "Hoechst", która służy jako kontrola pozytywna do barwienia i ustawienia cytometru przepływowego.
   2. Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres punktowy" (piąty obrazek w prawym górnym rogu) i utwórz wykres w arkuszu globalnym. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz FSC-A (rozproszenie do przodu), a na odciętych, SSC-A (rozproszenie boczne) (Rysunek 1A). W ten sam sposób utwórz wykres punktowy SSC-W i SCC-H. Na tym drugim wykresie kropkowym, aby utworzyć region P1, kliknij "Brama wielokątna" (czternaste zdjęcie w prawym górnym rogu) (Rysunek 1B).
      nuta: Region P1 będzie obejmował pojedyncze komórki i dyskryminujące dublety.
   3. Opcjonalnie: Wyklucz komórki PI dodatnie, tworząc FSC-A i PI bramkowane na P1. Na tym wykresie kropkowym wybierz populację dodatnich komórek PI (P2), aby wykluczyć martwe komórki dodatnie PI.
   4. Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres kropkowy" i utwórz wykres w globalnym arkuszu. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz niebieski Hoechst-A, a na odciętych, czerwony Hoechst-A. Klikając prawym przyciskiem myszy na populację, wybierz "Pokaż populację" i P1. Na tym wykresie kropkowym utwórz region (P2), aby wybrać ujemne komórki populacji po stronie barwnika Hoechsta (SP), które pojawiają się jako boczne ramię po lewej stronie głównej populacji komórek (Rysunek 1C).
2. Przeanalizuj próbkę "Hoechst" i zbierz 10 000 zdarzeń. Aby upewnić się, że bramka P2, która reprezentuje populację SP, jest dobrze ustawiona, przeanalizuj próbkę "Hoechst i Verapamil" (10 000 zdarzeń), aby zaobserwować zanik populacji SP (Figura 1D).
3. Zebrać ujemne komórki barwnika SP Hoechst w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml CM-CSC przygotowanej w kroku 1.1.1.
4. Pod koniec sortowania komórek odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml CM-CSC. Policzyć liczbę posortowanych komórek za pomocą licznika komórek i przenieść odpowiednią liczbę komórek do kolby hodowlanej (patrz tabela 1). Dodać CM-CSC i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze CO_{2 .}
5. Utrzymywać komórki w hodowli w tych samych warunkach przez maksymalnie dwa pasaże, aż do uzyskania co najmniej 5 x 10⁷ komórek.

Tabela 1: Typ kolby hodowlanej, który należy stosować w zależności od liczby posortowanych komórek. Podano szczegóły dotyczące wielkości kolby hodowlanej dla przybliżonej liczby posortowanych komórek. Podaje się również objętość trypsyny i objętość pożywki wymaganą dla typu kolby hodowlanej.

Liczba posortowanych komórek	Typ kolby hodowlanej	Objętość trypsyny (ml)	Objętość podłoża hodowlanego (ml)
10 000-200 000	1 dołek na płytce 6-dołkowej lub szalce Petriego o średnicy 3,5 cm	0,5	cyfra arabska
200 000-1 000 000	1 kolba hodowlana T25	1	4
1 000 000 >	1 kolba hodowlana T75	cyfra arabska	10

Wyniki

Rysunek 1: Izolacja populacji bocznej z wyłączeniem barwnika Hoechsta.(A) Wykres punktowy FSC-A i SSC-A. (B) Wykres punktowy SSC-W kontra SSC-H. (C, D) Wykres punktowy Hoechst Red-A kontra Hoechst Blue-A przy użyciu rurki "Hoechst" (C) lub rurki "Hoechst i Verapamil" (D).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Złota surowica cielęca płodu	GE Opieka zdrowotna	A15-151
Hydrokortyzon rozpuszczalny w wodzie	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicylina/Streptomycyna 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 61965-026
F12 Mieszanka orzechów (1x) + GlutaMAX-I	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 31765-027
EFG (EFG	Preparat Promega	Klasa G5021	Roztwór musi być przygotowany tuż przed użyciem, ponieważ jest to bardzo niestabilny
heparyna	Technologie StemcellTM	Numer katalogowy 7980
B-27 Suplement (50x), minus witamina A	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12587-010
Penicylina/Streptomycyna 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 61965-026
B-27 Suplement (50x), minus witamina A	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 14533	Toksyczność, ostra (doustna, przez skórę, wdychanie) kategoria 4
Chlorowodorek werapamilu	Sigma-Aldrich	V-4629	Toksyczność ostra (doustna, skórna, wdychanie) kategorii 3
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4170	Toksyczność ostra (doustna, skórna, wdychanie) kategorii 4
Linia komórkowa SQ20B	Prezent od John Little's Laboratorium	-
Linia komórkowa FaDu	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-43
Oprogramowanie BD FACSDiva v8.0.1	BD Nauki biologiczne	-

) TGL powiedział: powiedział: