1. Przygotowanie materiałów
- Szkiełka nakrywkowe w autoklawie
- Umieść szkiełka nakrywkowe w szklanej zlewce.
- Przykryj szklaną zlewkę folią.
- Autoklaw w temperaturze 121 °C przy ciśnieniu 15 psi przez 20 min.
- Suszyć w temperaturze 50 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej w okapie hodowlanym.
- Przygotuj roztwór utrwalający: 3% paraformaldehydu + 2% sacharozy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
- Do szklanej butelki o pojemności 1 000 ml dodaj 700 ml PBS i 30 g paraformaldehydu.
ostrożność: Paraformaldehyd jest, należy nosić odpowiednie rękawice.
- Całkowicie rozpuść paraformaldehyd, ogrzewając go do temperatury 80 °C za pomocą kuchenki mikrofalowej.
ostrożność: Opary paraformaldehydu są toksyczne, noś maskę.
- Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 20 g sacharozy.
- Dodaj PBS, aby całkowita objętość wynosiła 1 l.
- Podwielokrotność w probówkach o pojemności 50 ml. Roztwór utrwalający może być przechowywany przez 3 lata w temperaturze -20 °C lub przez 3 miesiące w temperaturze 4 °C.
2. Napromieniowanie
UWAGA: Z promiennikiem rentgenowskim należy obchodzić się ostrożnie, zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zbadaj komórki pod mikroskopem z odwróconymi fazami. Upewnij się, że komórki są przymocowane do szkiełka nakrywkowego i żywe.
- Naświetlić czaszę promieniami rentgenowskimi 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5%CO2,
nuta: Czas inkubacji można modyfikować zgodnie z projektem eksperymentalnym
3. Fiksacja
- Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia.
- Za pomocą nożyczek odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl w odległości 5 mm od końca.
nuta: Wycięta końcówka pomaga płynnie nałożyć roztwór utrwalający.
- Za pomocą odciętej końcówki dodaj 1 ml roztworu utrwalającego (przygotowanego w kroku 1.2) do naczynia ze ściany bocznej naczynia.
nuta: Ten etap jest zależny od czasu i dlatego powinien być wykonywany bez wymiany końcówek mikropipet w przypadku pracy z wieloma próbkami. Nałożenie roztworu utrwalającego bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.
- Umieść naczynie w kwadratowym naczyniu do hodowli. Delikatnie potrząśnij kwadratowym naczyniem hodowlanym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym.
- Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać roztwór utrwalający z naczynia.
- Dodaj 2 ml PBS do naczynia ze ścianki bocznej naczynia.
nuta: Nałożenie PBS bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.
- Odessać PBS z naczynia.
- Powtórz kroki 3.7 i 3.8 dwa razy.
nuta: Danie można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C, a szkiełka nakrywkowe są skąpane w 2 ml PBS.
4. Barwienie DAPI
- Na szkiełko podstawowe nanieść 5 μl 1 μg/ml odczynnika barwiącego DAPI.
nuta: Odczynnik barwiący DAPI jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli jest przechowywany w sposób chroniony przed światłem w temperaturze -20 °C lub niższej.
- Za pomocą skalpela usuń szkiełko nakrywkowe z naczynia.
- Odciągnij nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym.
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkiełku podstawowym tak, aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI.
nuta: Ten krok jest wrażliwy na czas. Wysuszenie odczynnika barwiącego DAPI może prowadzić do nieoptymalnego barwienia.
- Próbki można przechowywać przez 1 rok w temperaturze -20 °C.
