Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie bezkomórkowego rusztowania przełyku
- Uzyskaj nienaruszony przełyk świń w rzeźni ze świeżo ubitych świń rasy Landrace, które są wykorzystywane do produkcji żywności. Pojedynczy przełyk zapewni wystarczającą ilość rusztowań dla około 30 oddzielnych konstrukcji.
nuta: Ze względu na wymagany obszerny i czasochłonny protokół sterylizacji, zwykle warto uzyskać i przetworzyć minimum 10 przełyków za jednym razem.
- Natychmiast umieść świeżo wycięty przełyk w sterylnym garnku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml 10% roztworu jodu powidonu na 5 minut, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Przenieś przełyk do drugiego garnka zawierającego około 100 ml sterylnego PBS zawierającego 200 j.m./ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B.
- Załóż pokrywkę na pojemnik i przetransportuj przełyk z powrotem do laboratorium w temperaturze pokojowej. W każdym pojemniku można przewozić dwa lub trzy przełyki, w zależności od ich wielkości.
- Po przybyciu do laboratorium należy obchodzić się z tkanką w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu techniki aseptycznej, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Wysterylizuj pęsety, nożyczki i ostrza skalpela, mocząc przez 5 minut w 70% etanolu i spłukując w sterylnym PBS.
- Dotykaj przełyku za pomocą sterylnej pęsety. Za pomocą nożyczek rozetnij przełyk wzdłużnie. Opłucz tkankę, umieszczając przełyk w sterylnym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym około 100 ml sterylnego PBS i delikatnie wstrząsając, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
- Wyczyść deskę do preparowania korka, spryskując obficie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
- Wyjmij przełyk z PBS i za pomocą sterylnych igieł przypnij przełyk do deski, powierzchnią błony śluzowej do góry. Chwyć powierzchnię błony śluzowej na jednym końcu przełyku sterylną pęsetą i oderwij od deski. Spowoduje to oddzielenie błony śluzowej od leżącej pod nią błony podśluzowej.
- Następnie użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wyciąć przełyk wzdłużnie wzdłuż blaszki właściwej, usuwając szpilki w miarę postępu sekcji, aby umożliwić usunięcie błony śluzowej.
- Zachowaj wypreparowaną błonę śluzową i odrzuć leżącą pod nią błonę podśluzową.
- Odetnij i odrzuć najbardziej proksymalne i dystalne 2 cm błony śluzowej, ponieważ w tych obszarach znajduje się odpowiednio większa liczba gruczołów podśluzówkowych i grubsza blaszka właściwa.
- Za pomocą skalpela pokrój pozostałą tkankę na 5 cm2. Umieść całą pociętą tkankę w sterylnym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml sterylnego PBS i delikatnie mieszaj, aby spłukać tkankę. Jeśli przetwarzasz więcej niż pięć przełyków jednocześnie, może być konieczne użycie wielu doniczek do tego i trzech kolejnych kroków.
- Za pomocą sterylnej pęsety przenieś pociętą tkankę do garnka o pojemności 180 ml zawierającego 150 ml sterylnego 1 M NaCl, 200 IU / ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.
- Umieść tkankę w świeżym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym 150 ml sterylnego PBS. Nabłonek zacznie widocznie oddzielać się od leżącej pod nim tkanki. Delikatnie oderwij odklejający się nabłonek od przełyku świni za pomocą sterylnych kleszczy i wyrzuć.
- Umieść pozostałą tkankę w świeżym garnku o pojemności 180 ml i dodaj 150 ml sterylnego PBS. Mieszaj delikatnie przez 5 minut do umycia. Odlej PBS i powtórz kolejne dwa razy ze świeżym PBS.
- Umieść całą tkankę w szklanej butelce o pojemności 500 ml zawierającej 400 ml sterylnego 80% (v/v) roztworu glicerolu na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść do 400 ml sterylnego 90% (v/v) roztworu glicerolu na kolejne 24 godziny.
- Przechowywać w 400 ml sterylnego roztworu 100% glicerolu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 miesiące w celu odwodnienia i wysterylizowania tkanki przy zachowaniu integralności błony podstawnej.
