Ekstrakcja egzosomów na bazie kulek magnetycznych: technika izolowania określonych egzosomów z biopłynów

Streszczenie

Źródło: Tu, M. et al. Wykrywanie biomarkerów egzosomalnych za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie demonstrujemy procedurę izolowania egzosomów od docelowych płynów biologicznych za pomocą mikrokulek magnetycznych. Procedura umożliwia szybkie wychwytywanie egzosomów, które można wykorzystać do dalszej analizy.

Protokół

1. Ekstrakcja egzosomów na bazie kulek magnetycznych

1. Odpipetować dobrze wymieszany roztwór 5 μl mikrocząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną z 495 μl buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce do mikrowirówki w celu ponownego zawieszenia kulek. Umyj i ponownie zawieś kulki z 500 μl PBS trzykrotnie za pomocą stojaka magnetycznego. Stojak to układ magnesów z boku obudowy, który może pomieścić probówki do mikrowirówek z próbkami.
   1. Przy każdym myciu najpierw pozostaw probówki na stojaku na 1 minutę, a następnie użyj końcówki pipety, aby ostrożnie usunąć bufor supernatantu, nie naruszając kulek.
   2. Umieść rurki na zwykłym stojaku bez magnesów z boku. Dodać 500 μl PBS do probówek i za pomocą pipety wymieszać ze sobą roztwór i kulki. Następnie umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym, aby ponownie oddzielić kulki od roztworu.
   3. Wykonaj to usunięcie buforu poprzez namagnesowanie i ponowne zawieszenie w PBS w sumie trzy razy. To powoduje wstępne płukanie cząstek magnetycznych.
2. Ponownie zawiesić kulki w 490 μl buforu PBS, z rurką umieszczoną na nienamagnesowanej części stojaka magnetycznego. Odpipetować 5 μl biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD63 o stężeniu podstawowym 1,0 mg/ml do mieszaniny kulek. Za pomocą pipety wymieszaj kulki i przeciwciało w roztworze.
3. Umieścić probówki do mikrowirówek z kulką i mieszaniną przeciwciał biotynylowanych na rotatorze próbek. Ustaw parametry rotatora dla rotatora próbki na obrót posuwisto-zwrotny pod kątem 90°, przechylanie przez 5 s i wibracje pod kątem 5° przez 1 s. Obracać probówki mieszaniny kulek do pobierania próbek przy tych parametrach przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usuń niezwiązane przeciwciało po koniugacji.
   1. Po 30 minutach obrotu w temperaturze RT umieść rurki z powrotem w stojaku magnetycznym na 5 minut.
   2. Wykonać trzy płukania kulek, usuwając fazę ciekłą za pomocą mikropipety i przemyć 500 μl PBS. Po potrójnym umyciu ponownie zawieś kulki w 490 μl kazeiny-PBS i umieść je na nienamagnesowanej części stojaka.
5. Ekstrakcja egzosomów za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami.
   1. Oznaczyć każdą probówkę identyfikatorem próbki docelowej. Pobrać pipetę z 10 μl próbki surowicy lub śliny do probówki do mikrowirówki. Za pomocą pipety wymieszaj próbkę i kulki magnetyczne, pipetując ją kilka razy.
   2. Umieścić probówki z próbką i kulkami przeciwciała anty-ludzkiego CD63 na rotatorze i obracać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Użyć tych samych parametrów rotatora, jak opisano w kroku 1.3.
   3. Po 2 godzinach obracania próbki należy przeprowadzić potrójne płukanie, magnesując w celu oddzielenia kulek od roztworu, usuwając fazę ciekłą za pomocą mikropipety i ponownie zawieszając kulki w 500 μl buforu Tris-HCl. Powstałe w ten sposób kulki są teraz związane z egzosomami i są gotowe do uwolnienia i pomiaru pola elektrycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biotynylowane przeciwciało anty-ludzkie CD63	Ancell, Stany Zjednoczone Ameryki	215-030
Dynabeads MyOne Streptawidyna T1	Invitrogen, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 65601
Magnesy neodymowe (średnica 1/10" x grubość 1/32")	K&J Magnetics, Stany Zjednoczone	DH101
Ultraczysta woda destylowana	Life Technologies, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 10977-023
Anti-Fluorescein-POD, fragmenty Fab	Roche, Niemcy	11426346910
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami	Life Technologies, Stany Zjednoczone	10010023
Kazeina/PBS	Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 37532