$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Trawienie tkankowe
- Używając płytki do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, mechanicznie zmielić tkankę na drobne kawałki o wielkości ~1–2 mm za pomocą sterylizowanych w autoklawie nożyczek preparacyjnych i kleszczy chirurgicznych (ryc. 1B, C). Tkanka łączna między kawałkami powinna zostać przecięta, aby zapewnić prawidłowe oddzielenie i łatwość w dalszych krokach.
- Dodać 6 ml roztworu dypazy/kolagenazy do tkanki mielonej. Następnie inkubować w temperaturze 37°C przez około 30 minut do 1 godziny.
- Przerwać tkankę, pipetując pipetą serologiczną o pojemności 5 ml 15–20 razy.
- Inkubować w temperaturze 37°C przez kolejne 30 minut do 1 godziny.
- Powtórz kroki 1.3 i 1.4 jeszcze dwa-trzy razy lub do momentu, gdy tkanka zacznie przypominać zawiesinę i będzie mogła łatwo przejść przez otwór pipety (Rysunek 1D).
nuta: Początkowy rozmiar próbki tkanki i stopień rozdrobnienia tkanki określą, ile razy należy powtórzyć kroki 1.3 i 1.4. Zazwyczaj otrzymujemy tkankę o wymiarach około 1 cm x 1 cm. Dodatkowo można monitorować dysocjację tkanek za pomocą standardowego mikroskopu do odwróconych kultur tkankowych, aby śledzić postęp dysocjacji komórek z tkanki. Małe skupiska komórek są idealne do początkowego wzrostu komórek ślinowych w postaci salkuli.
2. Powlekanie studni matrycą membranową piwnicy
UWAGA: Matryca membrany podstawnej (BMM) powinna być rozmrożona przez noc w temperaturze 4°C dzień przed jej użyciem. Po rozmrożeniu BMM powinien być stale utrzymywany na lodzie lub w temperaturze 4°C, ponieważ w wyższych temperaturach szybko zestala się (tj. tworzy żel). Ponadto należy zachować ostrożność, jeśli próbki zostały schłodzone na lodzie przed posiewem na BMM, ponieważ zimne próbki "stopią" BMM i wystawią komórki na działanie plastikowego naczynia.
- Powoli pipetować BMM (patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki, która ma być pokryta. Równomiernie i powoli rozprowadź BMM na studni.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, używamy 500 μl na każdy dołek płytki 6-dołkowej, ale objętość tę można dostosować do użycia na innych wariantach płytek, takich jak 12-dołkowe lub 24-dołkowe, lub w razie potrzeby dla grubszych lub cieńszych hydrożeli.
- Inkubować powlekane płytki w temperaturze 37°C przez co najmniej 15 minut przed użyciem, aby BMM miał czas na zestalenie się.
3. Filtrowanie niestrawionych tkanek, liza RBC i posiewanie komórek
- Przenieść homogenat tkankowy z etapu 1,5 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć płytkę raz 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w celu przeniesienia pozostałych komórek.
- Przefiltrować homogenat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek z nylonowej siatki o średnicy 70 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę. Odcedzone komórki odwirowywać przez 5 minut przy 500 x g.
- Rozcieńczyć 10x bufor do lizy RBC w sterylnym dH2O, aby uzyskać 1x roztwór roboczy.
- Odessać supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml 1x buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C.
- Dodaj 20-25 ml DPBS, aby zneutralizować bufor do lizy RBC i zminimalizować lizę komórek śliny. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
nuta: Po leczeniu buforem do lizy RBC osad komórkowy powinien być biały. Czerwony kolor w granulce wskazuje, że nie wszystkie erytrocyty zostały w pełni zneutralizowane. W razie potrzeby powtórz kroki od 3.4 do 3.5, aby uzyskać całkowitą lizę wszystkich krwinek czerwonych.
- Odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w 1-2 ml BEGM na studzienkę, a następnie umieścić zawieszone komórki w studzienkach pokrytych BMM. Inkubować w temperaturze 37°C.
- Po posianiu na BMM komórki uformują się w kuliste struktury lub "salisfery" w ciągu 2-3 dni. Komórki mogą być utrzymywane jako ślikule przez około 5-7 dni, zanim BMM zacznie ulegać degradacji, umożliwiając komórkom dostęp i przyleganie do plastiku oraz wzrost jako monowarstwa.