Kwantyfikacja oparta na nanocząstkach sprzężonych z przeciwciałami przy użyciu mikroskopii ciemnego pola: procedura wychwytywania i ilościowego oznaczania określonych egzosomów z płynów ustrojowych

Abstract

Źródło: Wan, M. et al. Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego oznaczania egzosomów pochodzących z guza. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje użycie mikroskopii ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych egzosomów w próbkach biofluidycznych o małej objętości. Zidentyfikowane w ten sposób egzosomy mogą służyć jako potencjalne biomarkery raka.

Protocol

1. Przygotowanie sond nanocząstek

UWAGA: Ten test wykorzystuje funkcjonalizowane nanopręty złota (AuNR; średnica 25 nm x długość 71 nm), które są kowalencyjnie sprzężone z polimerami neutrawidyny (AV) i mają powierzchniowy pik rezonansu plazmonowego, który wytwarza czerwony (pik 641 nm) sygnał rozpraszający po oświetleniu DFM.

1. Przepłukać 40 μl AuNR-AV (2,56 x 10¹¹ cząstek) trzykrotnie 200 μl PBS (pH 7,0) przez odwirowanie i aspirację (8 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie końcowy etap wirowania i aspiracji, po którym osad AuNR-AV zawiesza się w 40 μl PBS.....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Repeater strumień	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0,1 – 2,5 μL, ciemnoszary
Funkcjonalizowane złote nanopręty	Nanopartz powiedział:	C12-25-650-TN-DIH-50-1	Polimer neutrawarydyny in vitro Funkcjonalizacja
Mieszalnik próbek HulaMixer	Thermo Fisher Naukowy	15920D
Wytrząsarka do kamułek 10L	Benchmark naukowy	H1010
Odwrócony mikroskop badawczy	Nikon	Ti-DH	Z kondensatorem ciemnego pola, DS-Ri2 kamera i Ti-SH-U universal uchwyt i zmotoryzowany stolik
Elementy NIS	Nikon		Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30256.02	Klon HyClone
Szkło poddane obróbce białkiem A/G Szkiełka podłoża	Arrayit Corp.	AGMSM192BC	Wysokiej jakości podłoże do mikromacierzy
Dźwiękomierz Q500	Qsonica, Sp. z o.o	Q500-110	Z sondą standardową (#4220)
Bufor blokujący superblok	Thermo Scientific
ANIMACJA 20	Sigma Nauki Przyrodnicze	9005-64-5