1. Przygotowanie sond nanocząstek
UWAGA: Ten test wykorzystuje funkcjonalizowane nanopręty złota (AuNR; średnica 25 nm x długość 71 nm), które są kowalencyjnie sprzężone z polimerami neutrawidyny (AV) i mają powierzchniowy pik rezonansu plazmonowego, który wytwarza czerwony (pik 641 nm) sygnał rozpraszający po oświetleniu DFM.
- Przepłukać 40 μl AuNR-AV (2,56 x 1011 cząstek) trzykrotnie 200 μl PBS (pH 7,0) przez odwirowanie i aspirację (8 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie końcowy etap wirowania i aspiracji, po którym osad AuNR-AV zawiesza się w 40 μl PBS.
- Zmieszać tę zawiesinę AuNR-AV z 10 μl biotynylowanego przeciwciała (0,5 mg/ml) specyficznego dla antygenu na powierzchni podtypu egzosomu będącego przedmiotem zainteresowania i 150 μl PBS, a następnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą mieszalnika, aby umożliwić zakończenie wiązania neutrawityny-biotyny.
- Otrzymane sprzężone z przeciwciałami AuNR (AuNR-IgG) przemyć trzykrotnie przez odwirowanie i aspirację (6 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie zawiesić je w 200 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
nuta: Należy stosować sterylną technikę i krótkie czasy przechowywania, aby uniknąć zanieczyszczenia i degradacji AuNR-IgG. Najlepiej jest stosować AuNR sprzężone z przeciwciałami w ciągu 24 godzin od ich koniugacji.
2. Przygotowanie slajdów do przechwytywania EV
- Rozcieńczyć wybrane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 0,025 mg/ml w PBS i dodać 1 μl/basenik tego rozcieńczenia na wielodołkowym szkiełku białkowym A/G, a następnie inkubować ten szkiełko w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wilgotnej komorze, aby umożliwić wiązanie przeciwciała wychwytującego z białkiem A/G unieruchomionym na szkiełku.
- Odessać studzienki w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i przemyć je trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl / studzienkę PBS. Następnie obciążyć każdą studzienkę 1 μl buforu blokującego (patrz tabela materiałów) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze w celu zablokowania wszelkich pozostałych miejsc wiązania białek.
- Odessać studzienki w celu usunięcia buforu blokującego, umyć studzienki trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl / studzienkę PBS i natychmiast użyć zablokowanych szkiełek do wychwytywania i analizy egzosomów.
3. Przygotowanie krzywej standardowej
- Aby dokładnie określić ilościowo bezwzględną lub względną obfitość określonego podtypu egzosomu, użytkownik musi wygenerować standardową krzywą z czystą populacją egzosomów, która jednolicie wyraża interesujący nas biomarker powierzchni egzosomu. W badaniu tym przeanalizowano obfitość egzosomów wyrażających białko błonowe związane z przerzutami, receptor Efryny A2, które ma zgłoszony związek ze stopniem zaawansowania raka trzustki i rokowaniem.
nuta: Wiadomo, że ludzka linia komórkowa raka trzustki PANC-1 i jej egzosomy wyrażają to białko, a izolowane egzosomy z tej linii komórkowej wykorzystano do wygenerowania standardowej krzywej w celu ilościowego określenia liczby egzosomów, które wyrażają to białko w złożonych próbkach egzosomów.
- Hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w pożywkach hodowlanych bez surowicy, aby umożliwić akumulację egzosomów w pożywce, a następnie wyizolować supernatanty do hodowli komórkowych przez odwirowanie kultur zawiesinowych lub bezpośrednią aspirację pożywek hodowlanych z przylegających kultur komórkowych.
- Odwirować zebrane podłoże o sile 2000 x g przez 30 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń i odzyskania supernatantu.
- Przefiltrować sklarowany supernatant kultury przez jednostkę filtrującą o niskiej zawartości wiązania białek o odpowiedniej pojemności 0,45 μm (np. jednostkę filtracji próżniowej z polieterosiulfonem o pojemności 250 ml).
- Zagęścić otrzymany filtrat przez odwirowanie przy 3200 x g przy użyciu systemu filtrów granicznych o nominalnej masie cząsteczkowej 100 000 do końcowej objętości 250 μl. Zbierz zatrzymaną objętość z tego filtra, a następnie umyj filtr 200 μl PBS i połącz tę objętość płukania z objętością zebranej próbki egzosomu.
- Odwirować tę próbkę przy masie 21 000 x g przez 45 minut i ostrożnie odzyskać supernatant, uważając, aby nie zebrać żadnego wytrąconego materiału.
- Odwirować odzyskany supernatant o stężeniu 100 000 x g przez 3 godziny, aby wytrącić egzosomy. Odessać supernatant i zebrać osad egzosomu w 100 μl PBS.
- Powstałe zawiesiny egzosomów należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną zużyte w ciągu 24 godzin, lub w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
UWAGA: Nie poddawaj próbek egzosomów powtarzaniu cykli zamrażania i rozmrażania.
- Określić ilościowo podwielokrotność zawiesiny egzosomu po zmieszaniu przez bezpośredni pomiar liczby egzosomów (np. przez analizę śledzenia nanocząstek lub dostrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych lub przez pomiar stężenia białka w lizatach egzosomów za pomocą testu kwasu mikrobicynkowego lub równoważnej metody, jako sposób na przybliżenie ilości egzosomów).
- Wygeneruj zestaw seryjnych rozcieńczeń zawiesiny egzosomu, aby umożliwić porównanie sygnału nanocząstek z liczbą wejściową egzosomu lub zawartością białka.
- Przenieść 1 μl każdego wzorca egzosomu do każdej z jego kontrprób na płytce testowej.
UWAGA: Krzywe standardowe można wykorzystać do obliczenia nachylenia linii korelacji między sygnałem nanocząstek a stężeniem egzosomów w celu (1) oceny wydajności testu i (2) określenia względnego stężenia docelowych egzosomów w próbkach eksperymentalnych.
4. Przetwarzanie próbek ludzkiego osocza lub surowicy
- Pobrać próbki osocza lub surowicy standardowymi metodami i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do analizy egzosomów. Szybko rozmrozić próbki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy kilkakrotnie mieszać metodą inwersji, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
UWAGA: Wyniki próbek surowicy i osocza mogą nie być równoważne, ponieważ podczas reakcji krzepnięcia dochodzi do znacznego uwalniania egzosomów.
- Odwirować próbki osocza lub surowicy o masie 500 x g przez 15 minut w celu wytrącenia agregatów białkowych i innych zanieczyszczeń. Przenieść podwielokrotność próbki osocza lub surowicy do świeżej probówki i dodać PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1. Wymieszać rozcieńczoną próbkę przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku. Przenieść 1 μl każdej zawiesiny osocza lub surowicy do każdej z kontrprób na płytce testowej.
5. Wychwytywanie i wykrywanie egzosomów
- Załadować studzienki zablokowanego szkiełka wychwytującego EV 1 μl/studzienkę próbki egzosomu, stosując 8 powtórzeń na próbkę, i inkubować szkiełko przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Odessać wszystkie dołki na próbki, a następnie dodać 1 μl / studzienkę PBS, aby przemyć dołki i usunąć niezwiązane egzosomy i inne zanieczyszczenia z załadowanej próbki egzosomu.
- Do studzienek na próbki należy załadować 1 μl/basenik uprzednio przygotowanej zawiesiny AuNR-IgG (patrz sekcja 1 powyżej) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Zassać roztwór nanocząstek i przemyć szkiełko w PBS uzupełnionym 0,01% Tween-20 (PBST) przez 10 minut za pomocą mieszalnika, następnie odessać i przemyć wszystkie studzienki próbki wodą dejonizowaną przez 10 minut za pomocą mieszalnika obrotowego i wysuszyć na powietrzu w celu późniejszego obrazowania LMDFM.
UWAGA: Współczynniki zmienności między testami (CV) ocenia się na podstawie ośmiu powtórzeń tej samej próbki. Próbki, które wykazują CV >20%, są uważane za nieinformacyjne i należy je powtórzyć, jeśli jest wystarczająca próba.
