$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie CTC
- Obliczyć liczbę CTC potrzebną do wstrzyknięcia i przygotować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 1,0 ×10 4 komórek/μl w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zawiesinę komórkową umieszczać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania zabiegu.
nuta: W przypadku korzystania z linii komórkowych, które wymagają trypsynizacji, należy dwukrotnie umyć komórki sterylnym PBS, aby usunąć trypsynę. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Jeśli używana jest duża kohorta (>50 myszy), należy ponownie przeliczyć komórki i zweryfikować żywotność komórek między wstrzyknięciami, aby upewnić się, że na mysz podawana jest stała liczba komórek.
2. Zabieg przedoperacyjny
- Wstrzyknąć myszowi podskórnie 5 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (Bup-SR).
nuta: Nie należy wstrzykiwać miejsca proponowanego nacięcia; Wybrać miejsce wstrzyknięcia z dala od łopatki.
- Znieczulenie myszy 2-3% izofluranem do momentu, aż nie wykaże oznak odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić stan znieczulenia.
- Przygotuj mysz do zabiegu w miejscu oddalonym od obszaru operacyjnego. Przytnij miejsce operacji (tj. grzbietową powierzchnię czaszki) z wystarczającą powierzchnią graniczną, aby futro nie zanieczyściło miejsca nacięcia; Następnie nasącz miejsce bakteriobójczym środkiem antyseptycznym do skóry, działającym od środka miejsca do obrzeży, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Zastosuj sterylną serwetę lub sterylną obłogę z tworzywa sztucznego na podłożu samoprzylepnym, aby chronić miejsce operacji przed zanieczyszczeniem.
nuta: Narzędzia należy wcześniej sterylizować w autoklawie, a końcówki ponownie sterylizować między zwierzętami za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.
- Ogolić sierść na całej brzusznej powierzchni głowy i przygotować skórę techniką sterylną.
- Umieść nos ze zmodyfikowanym stożkiem nosowym w kształcie litery L aparatu stereotaktycznego, upewniając się, że nozdrza pozostają czyste i otwarte. Używając taśmy na brzusznych powierzchniach obu małżowin usznych, delikatnie pociągnij skórę do przodu, aby przymocować ją do stożka nosowego i zegnij szyję pod kątem około 90° po zabezpieczeniu. Podawać 1,5% izofluranu w celu utrzymania znieczulenia.
nuta: Prawidłowe ułożenie spowoduje, że obszar nacięcia zostanie przedstawiony w sposób pozwalający na łatwą identyfikację grzbietu ogonowego kości potylicznej.
- Ustaw tułów tak, aby grzbiet był utrzymywany na poziomie cisterna magna, a przy lekkim nacisku na ogon umieść taśmę u podstawy ogona, aby zabezpieczyć.
3. Chirurgiczne wstrzyknięcie Cisterna Magna
- Z pełnym wyprostem szyi i zaczynając tuż między małżowinami usznymi, przesuń końcówki nożyczek chirurgicznych w dół, lekko naciskając na kość potyliczną.
nuta: W tej pozycji środkowej zauważalne jest niewielkie wgłębienie, gdy końcówki nożyczek zanurzają się we wklęsłym obszarze nad cisterna magna.
- Wykonaj małe nacięcie linii środkowej o średnicy 3–5 mm tuż nad wklęsłością wyczuwalną palpacyjnie. Pobrać 5 μl zawiesiny komórek w temperaturze 1,0 × 104 komórek/μl (łącznie 5,0 ×10 4 komórek) do strzykawki Hamiltona o pojemności 30 g.
- Użyj szczypiec z końcówkami 1–2 mm, aby delikatnie docisnąć cisterna magna. Wprowadź końcówki w pozycji zamkniętej i otwórz je, wywierając nacisk na oponę twardą w dół.
- Powtarzaj rozwarstwienie opisane w poprzednim kroku, aż błona opony twardej zostanie łatwo zidentyfikowana, a związane z nią naczynia krwionośne będą widoczne w odsłoniętym obszarze.
nuta: Powstałe w ten sposób okienko iniekcyjne zapewnia, że naczynia krwionośne nie są uszkodzone podczas wprowadzania igły.
- Trzymając kleszcze otwarte, aby cofnąć otaczające mięśnie, wprowadź igłę 30 G bez rdzenia pod oponę twardą, aby uwidocznić skos. Upewnij się, że igła jest wprowadzona tylko tuż za samym skosem. Powoli wysuń tłok strzykawki i dostarcz komórki tuż poniżej opony twardej.
- Prawidłowo umieścić skos, aby obserwować wstrzyknięcie pod oponą twardą. Ostrożnie zastosuj technikę i użyj igły 30 G bez rdzenia, aby zapobiec uszkodzeniu membrany i zapewnić minimalny wyciek. W przypadku zauważenia wycieku delikatnie dociśnij aplikatorem z bawełnianą końcówką.
- Zamknij skórę, nakładając klips na ranę lub mikrokroplę kleju do skóry. Po pomyślnym wykonaniu wstrzyknięcia pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu na ciepłym kocu, obserwując je w sposób ciągły, aż będą w stanie utrzymać pozycję mostka i zademonstrować celowy ruch.
- Monitoruj myszy codziennie po operacji przez pierwszy tydzień. Jeśli mysz wydaje się odczuwać ból lub niepokój, należy ją leczyć podskórnym zastrzykiem karprofenu w dawce 10 mg/kg raz na 12 do 24 godzin przez okres do 5 dni w oparciu o konsultację weterynaryjną i dyrektywę. Pozwól myszom dojść do siebie i monitoruj je przez co najmniej 48 do 72 godzin przed przejściem do następnego kroku.
nuta: Bup-SR, podawany prewencyjnie, trwa do 72 godzin, więc dodatkowe leki przeciwbólowe zwykle nie są konieczne. Jednak w razie potrzeby zwierzętom zostaną dostarczone dodatkowe leki przeciwbólowe (jeśli są ospałe, nie jedzą, są potargane). Jeśli w miejscu operowanym pojawią się oznaki infekcji pooperacyjnej (tj. zaczerwienienie, obrzęk, tkliwość, allodynia, hiperalgezja, hiperpatia lub ropienie) lub jeśli mysz strzeże dotkniętego obszaru, należy poddać mysz eutanazji. Jeśli komórki rakowe zostaną pomyślnie wstrzyknięte do płynu mózgowo-rdzeniowego, LMD i progresja guza rozwiną się w OUN w ciągu 1 lub 2 tygodni (w zależności od typów CTC lub użytej linii komórkowej) (ryc. 1).
