Model komórek macierzystych glejaka znakowany lucyferazą: metoda przygotowania komórek macierzystych glejaka znakowanych lucyferazą do badań terapeutycznych in vitro za pośrednictwem lentiferazy

Streszczenie

Źródło: Hu, Z. et al. Szybki proces badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej dla GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzących od pacjenta. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje tworzenie komórek macierzystych glejaka znakowanych lucyferazą poprzez dostarczanie genów za pośrednictwem lentiwirusa. Lucyferazy działa jako gen reporterowy i ułatwia szybkie eksperymenty przesiewowe leków.

Protokół

1. Przygotowanie GSC oznaczonych lucyferazą

1. Rozpocząć od hodowli GSC i odwirować przy 70 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć supernatant i trawić komórki za pomocą akutazy przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Kilkakrotnie użyć końcówki o pojemności 200 μl i pipety, aby oddzielić i ponownie zawiesić osad komórkowy.
3. Rozcieńczyć komórki do 2 x 10⁵ komórek na studzienkę na 12-dołkowej płytce hodowlanej i hodować komórki przez noc.
4. Dodać 30 μl supernatantu wirusa lucyferazy-EGFP (miano >^10,8 j./ml) do każdego dołka na płytce, a następnie odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Hodować komórki przez noc.
5. Odśwież pożywkę następnego dnia i hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.
6. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić pojawienie się komórek GFP-dodatnich.
7. Użyj sortera komórek przepływowych, aby posortować i wybrać GSC o wysokiej fluorescencji GFP w celu dalszej hodowli komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B-27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044	50-krotny
EFG (EFG	Gibco (firma Gibco)	PHG0313	20 ng/ml
Współczynnik FGF	Gibco (firma Gibco)	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco (firma Gibco)	35050061	100-krotny
Neuropodstawowy	Gibco (firma Gibco)	21103049	1X
Penicylina-Streptomycyna	Klon HyClone	SV30010	P: 10 000 jednostek/ml S: 10 000 ug/ml
Pirogronian sodu	Gibco (firma Gibco)	2088876	100 mM

wzrost )