Method Article

Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Hu, Z. et al. Szybki proces badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej dla GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzących od pacjenta.J. Vis. Exp.(2021)

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pomiar żywotności komórek oparty na bioluminescencji

  1. Powlekanie płytek mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (np. Matrigel): Dodać 40 μl mieszaniny ECM o stężeniu 0,15 mg/ml do każdego dołka i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar mieszaniny ECM i delikatnie spłukać raz PBS.
  2. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej zawierającej 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 i 500 komórek XG387-Luc wraz ze 100 μl pożywki ślepej jako kontrolę do każdej studzienki dla 6 powtórzeń na 96-dołkowej optycznej płytce dolnej i hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Usunąć supernatant, dodać 50 μl pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania (ROI) i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

2. Leczenie temozolomidem i skojarzone badania przesiewowe

  1. Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć cztery 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej w kroku 1.
  2. Umieść komórki XG387-Luc o gęstości 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hoduj komórki przez noc.
  3. Należy wcześniej przygotować temozolomid i docelowe środki z roztworu podstawowego. Przygotować serię stężeń składającą się z 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM i 50 μM temozolomidu w pożywce do leczenia pojedynczym środkiem. Rozcieńczyć temozolomid i środki docelowe w roztworze podstawowym w pożywce, odpowiednio, w celu uzyskania końcowych stężeń 200 μM i 2 μM do badań przesiewowych leków złożonych (wykaz materiałów).
  4. Usunąć pożywkę hodowlaną, gdy większość GSC przylega do dna płytek; dodać wyżej przygotowaną pożywkę zawierającą temozolomid do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.
  5. W celu poddania działaniu temozolomidu i przeprowadzenia badań przesiewowych kombinacji leków, należy usunąć pożywkę ślepą i dodać powyżej przygotowaną pożywkę zawierającą 200 μM temozolomidu lub 2 μM czynnika docelowego, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg.
  6. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.
  7. Usunąć pożywkę zawierającą lek, dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele cyklicznych zwrotów z inwestycji i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B-27Gibco (firma Gibco) Numer katalogowy: 17504-044 50-krotny
EFG (EFG Gibco (firma Gibco) PHG0313 20 ng/ml
Współczynnik FGF Gibco (firma Gibco) PHG0263 20 ng/ml
Gluta Max Gibco (firma Gibco) 35050061 100-krotny
Neuropodstawowy Gibco (firma Gibco) 21103049 1X
Penicylina-Streptomycyna Klon HyClone SV30010 P: 10 000 jednostek/ml S: 10 000 ug/ml
Pirogronian sodu Gibco (firma Gibco) 2088876 100 mM
ABT-737 MCE (Certyfikat MCE Selektywny i mimetyczny inhibitor Bcl-2 Bcl-xL i BH3
Adavosertib (MK-1775) MCE (Certyfikat MCE Inhibitor Wee1
Aksytynib MCE (Certyfikat MCE Wielokierunkowy inhibitor kinazy tyrozynowej
AZD5991 MCE (Certyfikat MCE Inhibitor Mcl-1
A 83-01 MCE (Certyfikat MCE Silny inhibitor kinazy ALK5 receptora TGF-β typu I
CGP57380 Selleck powiedział Silny inhibitor MNK1
Dactolisib (BEZ235) Selleck powiedział Podwójny ATPkonkurencyjny inhibitor PI3K i mTOR
Dazatynib MCE (Certyfikat MCE Podwójny inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Bcr-Abl i Src
Erlotynib MCE (Certyfikat MCE Inhibitor kinazy tyrozynowej EGFR
Gefitynib MCE (Certyfikat MCE Inhibitor kinazy tyrozynowej EGFR
Linifanib (Linifanib MCE (Certyfikat MCE Wielocelowy inhibitor z rodziny VEGFR i PDGFR
Masytynib MCE (Certyfikat MCE Inhibitor C-Kit
Zobacz materiał ML141 Selleck powiedział Niekompetycyjny inhibitor GTPazy Cdc42
OSI-930 MCE (Certyfikat MCE Wielocelowy inhibitor Kit, KDR i CSF-1R
Palbocyklib (palbocyklib MCE (Certyfikat MCE Selektywny inhibitor CDK4 i CDK6
SB 202190 MCE (Certyfikat MCE Selektywny inhibitor kinazy p38 MAP
Bromek sepantronium (YM-155) MCE (Certyfikat MCE Inhibitor surwiwiny
TCS 359 Selleck powiedział Silny inhibitor FLT3
UMI-77 MCE (Certyfikat MCE Selektywny inhibitor Mcl-1
4-hydroksytamoksyfen (afimosyfen) Selleck powiedział Selektywny modulator receptora estrogenowego (ER)
wzrost ) powiedział: ) ) ) ) ) : : ) ) ) ) ) ) : powiedział: ) ) ) ) ) : powiedział: ) :

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cellular BioluminescenceDrug ScreeningLuciferase AssayCombination TherapyCell ViabilityIVIS ImagingSerial DilutionECM CoatingTumor CellsSynergism Assessment

Related Articles