Test oparty na bioluminescencji komórkowej: wysokoprzepustowa metoda kombinatorycznych badań przesiewowych leków

Streszczenie

Źródło: Hu, Z. et al. Szybki proces badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej dla GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzących od pacjenta.J. Vis. Exp.(2021)

W tym filmie opisujemy metodę podkreślającą użyteczność testu bioluminescencyjnego do czułych i szybkich badań przesiewowych leków. Leki te mogą być testowane samodzielnie lub w połączeniu w celu oceny synergizmu w ich sposobie działania.

Protokół

1. Pomiar żywotności komórek oparty na bioluminescencji

1. Powlekanie płytek mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (np. Matrigel): Dodać 40 μl mieszaniny ECM o stężeniu 0,15 mg/ml do każdego dołka i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar mieszaniny ECM i delikatnie spłukać raz PBS.
2. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej zawierającej 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 i 500 komórek XG387-Luc wraz ze 100 μl pożywki ślepej jako kontrolę do każdej studzienki dla 6 powtórzeń na 96-dołkowej optycznej płytce dolnej i hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Usunąć supernatant, dodać 50 μl pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
4. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania (ROI) i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

2. Leczenie temozolomidem i skojarzone badania przesiewowe

1. Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć cztery 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej w kroku 1.
2. Umieść komórki XG387-Luc o gęstości 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hoduj komórki przez noc.
3. Należy wcześniej przygotować temozolomid i docelowe środki z roztworu podstawowego. Przygotować serię stężeń składającą się z 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM i 50 μM temozolomidu w pożywce do leczenia pojedynczym środkiem. Rozcieńczyć temozolomid i środki docelowe w roztworze podstawowym w pożywce, odpowiednio, w celu uzyskania końcowych stężeń 200 μM i 2 μM do badań przesiewowych leków złożonych (wykaz materiałów).
4. Usunąć pożywkę hodowlaną, gdy większość GSC przylega do dna płytek; dodać wyżej przygotowaną pożywkę zawierającą temozolomid do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.
5. W celu poddania działaniu temozolomidu i przeprowadzenia badań przesiewowych kombinacji leków, należy usunąć pożywkę ślepą i dodać powyżej przygotowaną pożywkę zawierającą 200 μM temozolomidu lub 2 μM czynnika docelowego, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg.
6. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni.
7. Usunąć pożywkę zawierającą lek, dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
8. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele cyklicznych zwrotów z inwestycji i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B-27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044	50-krotny
EFG (EFG	Gibco (firma Gibco)	PHG0313	20 ng/ml
Współczynnik FGF	Gibco (firma Gibco)	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco (firma Gibco)	35050061	100-krotny
Neuropodstawowy	Gibco (firma Gibco)	21103049	1X
Penicylina-Streptomycyna	Klon HyClone	SV30010	P: 10 000 jednostek/ml S: 10 000 ug/ml
Pirogronian sodu	Gibco (firma Gibco)	2088876	100 mM
ABT-737	MCE (Certyfikat MCE		Selektywny i mimetyczny inhibitor Bcl-2 Bcl-xL i BH3
Adavosertib (MK-1775)	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor Wee1
Aksytynib	MCE (Certyfikat MCE		Wielokierunkowy inhibitor kinazy tyrozynowej
AZD5991	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor Mcl-1
A 83-01	MCE (Certyfikat MCE		Silny inhibitor kinazy ALK5 receptora TGF-β typu I
CGP57380	Selleck powiedział		Silny inhibitor MNK1
Dactolisib (BEZ235)	Selleck powiedział		Podwójny ATPkonkurencyjny inhibitor PI3K i mTOR
Dazatynib	MCE (Certyfikat MCE		Podwójny inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Bcr-Abl i Src
Erlotynib	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor kinazy tyrozynowej EGFR
Gefitynib	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor kinazy tyrozynowej EGFR
Linifanib (Linifanib	MCE (Certyfikat MCE		Wielocelowy inhibitor z rodziny VEGFR i PDGFR
Masytynib	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor C-Kit
Zobacz materiał ML141	Selleck powiedział		Niekompetycyjny inhibitor GTPazy Cdc42
OSI-930	MCE (Certyfikat MCE		Wielocelowy inhibitor Kit, KDR i CSF-1R
Palbocyklib (palbocyklib	MCE (Certyfikat MCE		Selektywny inhibitor CDK4 i CDK6
SB 202190	MCE (Certyfikat MCE		Selektywny inhibitor kinazy p38 MAP
Bromek sepantronium (YM-155)	MCE (Certyfikat MCE		Inhibitor surwiwiny
TCS 359	Selleck powiedział		Silny inhibitor FLT3
UMI-77	MCE (Certyfikat MCE		Selektywny inhibitor Mcl-1
4-hydroksytamoksyfen (afimosyfen)	Selleck powiedział		Selektywny modulator receptora estrogenowego (ER)

wzrost ) powiedział: ) ) ) ) ) : : ) ) ) ) ) ) : powiedział: ) ) ) ) ) : powiedział: ) :