Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mikrogleju oparta na SEC: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek hodowlanych kondycjonowanych mikroglejem

Abstract

Źródło: Lemaire, Q. et al. Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje metodę opartą na chromatografii wykluczania wielkości (SEC) do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV pochodzących z komórek odpornościowych mózgu - mikrogleju. EV działają jak ładunek molekularny, dostarczając mediatory, które regulują odpowiedź immunologiczną. W związku z tym wyizolowane EV mogą być wykorzystane jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań mikrogleju i neuronów podczas neuronalnej odpowiedzi immunologicznej.

Protocol

1. Pierwotna hodowla mikrogleju/makrofagów

1. Pierwotna kultura mikrogleju
   1. Hodowla komercyjnego pierwotnego mikrogleju szczura (2 x 10⁶ komórek) (patrz tabela materiałów) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% surowicą wolną od egzosomów, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 9,0 g/l glukozy w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 48 godzinach posiewu i przystąpić do izolacji EV.
2. Pierwotna hodowla makrofagów
   1. Hodowla komercyjnych pierwotnych makrofagów szczurów (1 x 10⁶ komórek) w pożywce dostarczonej przez producenta (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 z} surowicą wolną od egzosomów.
   2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 24-godzinnej hodowli i przystąpić do izolacji EV.

2. Izolacja EV

1. Wstępna izolacja pojazdów elektrycznych od kondycjonowanego podłoża
   1. Przenieść kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z kultur mikrogleju lub makrofagów (etapy 1.1.2 lub 1.2.2) do stożkowej probówki.
   2. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu osadzenia komórek.
   3. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki. Wirować przy 1,200 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania ciał apoptotycznych.
   4. Przenieść supernatant do probówki z poliwęglanu o pojemności 10,4 ml i przenieść probówkę do wirnika 70,1 Ti. Ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu granulowania EVs.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający EV w 200 μl 0,20 μm przefiltrowanego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).
2. Izolacja pojazdów elektrycznych
   1. Przygotowanie domowej roboty kolumny do chromatografii wykluczającej wielkość (SEC)
      1. Szklaną kolumnę chromatograficzną (długość: 26 cm; średnica: 0,6 cm) należy opróżnić (patrz tabela materiałów), umyć ją i wysterylizować.
      2. Umieść filtr 60 μm na dole kolumny.
      3. Ułóż kolumnę z usieciowaną matrycą filtracyjną z żelu agarozowego, aby utworzyć fazę stacjonarną o średnicy 0,6 cm i wysokości 20 cm.
      4. Przepłukać fazę 50 ml przefiltrowanego PBS o stężeniu 0,20 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia w razie potrzeby.
   2. Umieść zawieszony granulat EV na górze nieruchomej fazy kolumny SEC.
   3. Zebrać 20 sekwencyjnych frakcji po 250 μl, kontynuując dodawanie 0,20 μm przefiltrowanego PBS na wierzchu fazy stacjonarnej, aby zapobiec wysuszeniu kolumny. W razie potrzeby należy przechowywać frakcje w temperaturze -20 °C.
      nuta: Przechowywanie w temperaturze -80 °C może być przechowywane dłużej niż tydzień, aby zachować integralność EV do analizy molekularnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pożywka do hodowli makrofagów i mikrogleju szczurów	Zastosowania komórkowe	Czynnik chłodniczy R620K-100	Pochodzenie komórki: Normalny zdrowy szczur szpik kostny
Pierwotny mikroglej szczura	Lonza	Zobacz materiał RG535
Sefaroza CL-2B	GE Opieka zdrowotna	17014001
Ultrawirówka	Beckman Coulter	A95765
Wirnik ultrawirówkowy 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
glukoza	Sigma-Aldrich	G8769
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	Invitrogen	14190094	Bez wapnia, bez magnezu
Probówki wirówkowe z poliwęglanu	Beckman Coulter	355651
Penicylina-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
Egzo-FBS	Ozyme powiedział:	EGZO-FBS-50A-1	FBS zubożony w egzosomy
DMEM Gibco 41966029
wirówka	Eppendorf	5804000010
Inkubator CO2	Rybak termiczny
pluriSitko M/ 60 μm	pluriSelect (wybierz pleri)	43-50060
Kolumna MonoP FPLC	GE Opieka zdrowotna		Nie jest już dostępny