Ekstrakcja białek związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi oparta na SDS-PAGE: procedura ekstrakcji białek z EV i przygotowania ich do trawienia w żelu

Streszczenie

Źródło: Lemaire, Q. et al. Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy metodę trawienia w żelu SDS-PAGE do ekstrakcji białek z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV. Po wyizolowaniu uzyskane fragmenty białka można wykorzystać do analizy proteomicznej.

Protokół

1. Charakterystyka pojazdów elektrycznych

1. Analiza Western Blot
   1. Ekstrakcja białek
      1. Wyizolować EV za pomocą kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i określić ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA).
      2. Zmieszać 50 μl buforu RIPA (150 mM chlorku sodu [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-kwasu tetraoctowego [EGTA], 2 mM kwasu etylenodiamino-tetraoctowego [EDTA], 100 mM fluorku sodu [NaF], 10 mM pirofosforanu sodu, 1% Nonidetu P-40, 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF], 1x inhibitor proteazy) z próbką EV (25 μL wynikającą ze stężenia EV na filtrze) przez 5 min na lodzie do Ekstrakcja białek.
      3. Sonikuj przez 5 s (amplituda: 500 W; częstotliwość: 20 kHz), 3 razy na lodzie.
      4. Usunąć resztki pęcherzykowe przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
      5. Zebrać supernatant i zmierzyć stężenie białka za pomocą metody testu białkowego Bradforda.
   2. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i western blotting
      1. Zmieszać ekstrakty białkowe (30 μg) z 5c buforem próbki Laemmli (v/v).
      2. Załaduj mieszankę białkową na 12% żel poliakrylamidowy.
      3. Migrować białka w żelu za pomocą buforu TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM glicyny i 0,1% SDS), przy 70 V przez 15 minut i 120 V przez 45 minut.
      4. Przenieść białka na membranę nitrocelulozową w systemie półsuchym pod napięciem 230 V przez 30 minut.
      5. Nasycać membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej buforem blokującym (0,05% Tween 20 w/v, 5% mleka w proszku w/v w 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu białku szoku cieplnego 90 (HSP90) rozcieńczonym w buforze blokującym (1:100).
      7. Umyj membranę trzykrotnie za pomocą PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) przez 15 minut.
      8. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kozio-chrzanową peroksydazą chrzanową sprzężonym z mysią przeciwciałem drugorzędowym IgG, rozcieńczonym w buforze blokującym (1:10 000).
         UWAGA: Kontrolę ujemną przeprowadza się przy użyciu samego przeciwciała drugorzędowego.
      9. Powtórz etap prania (krok 1.1.2.7).
      10. Odsłoń membranę za pomocą zestawu substratów do western blottingu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (patrz tabela materiałów).

2. Analiza proteomiczna

1. Ekstrakcja białka i trawienie w żelu
   1. Wyizolować EV za pomocą kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i określić ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Powtórz krok 1.1.1 dla ekstrakcji białka EV.
   2. Przeprowadzić migrację białek w żelu do układania w stos 12% żelu poliakrylamidowego.
   3. Utrwal białka w żelu za pomocą Coomassie blue przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Wyciąć każdy kolorowy kawałek żelu i pokroić go na małe kawałki o średnicy 1 mm³.
   5. Kawałki żelu przemywać kolejno 300 μl każdego roztworu: wodą ultraczystą przez 15 min, 100% acetonitrylem (ACN) przez 15 min, 100 mM wodorowęglanu amonu (NH₄HCO₃) przez 15 min, ACN: 100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) przez 15 min i 100% ACN przez 5 min z ciągłym mieszaniem.
   6. Wysuszyć całkowicie żelowe kawałki za pomocą koncentratora próżniowego.
   7. Przeprowadzić redukcję białka za pomocą 100 μL 100 mM NH₄HCO₃ zawierającego 10 mM ditiotreitolu przez 1 godzinę w temperaturze 56°C.
   8. Przeprowadzić alkilowanie białek za pomocą 100 μl 100 mM NH₄HCO₃ zawierającego 50 mM jodoacetamidu przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
   9. Przemywać kawałki żelu kolejno 300 μl każdego roztworu: 100 mM NH₄HCO₃ przez 15 min, ACN: 20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) przez 15 min i 100% ACN przez 5 min, ciągle mieszając.
   10. Całkowicie wysusz kawałki żelu za pomocą koncentratora próżniowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitrylu	Chemikalia rybackie	A955-1
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy 9830
Przeciwciało HSP90 α/β (RRID: AB_675659)	Święty Mikołaj	SC-13119
Bio-Rad Protein Assay Koncentrat odczynnika barwnikowego (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 43819
Kwas bis(2-aminoetylowy) glikolu etylenowego -N,N,N′,N′-tetraoctowy	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 03777-10G
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	ED-100G (Przekaźnik ED-100G
Sonikator Fisherbrand Q500 z sondą	Marka rybacka	12893543
Idoacetamid	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Barwnik Białkowy	Ekspedienta	ISB1L (Biblioteka ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Przywra	Numer katalogowy: 56741
Peroksydaza AffiniPure Goat AntiMouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 115-035-003
Koniugat falloidyny-tetrametylorodaminy	Święty Mikołaj	SC-362065
Inhibitor proteazy	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
chlorek sodu	Scharlau	Zobacz materiał SO0227
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	L3771
Fluorek sodu	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Pirofosforan sodu	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Koncentrator próżni SpeedVac	Rybak termiczny
Półsucha komórka transferowa Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940