$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Obrazowanie przyżyciowe
UWAGA: Odstęp czasu między wstrzyknięciem komórki nowotworowej a pierwszą sesją obrazowania przyżyciowego zależy od rodzaju użytej linii komórek nowotworowych. W eksperymentach pokazanych w tym protokole wstrzyknięto 1x 105 komórek GL261 i zobrazowano je 10 dni później.
- Przygotowanie do obrazowania
- Uspokoić mysz za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem przez maskę na twarz (1,5%-2% mieszanina izofluranu/O2).
- Wstrzyknąć mysz podskórnie 100 μl buforu soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.
nuta: W przypadku długotrwałego obrazowania mysz może być nawodniona przez podskórną pompę infuzyjną.
- Umieść mysz ekranem do góry w pudełku do obrazowania. Użyj metalowej płytki z otworem o średnicy 1 mm i małymi magnesami osadzonymi wokół otworu, aby zapewnić mocowanie CIW do pudełka obrazowania. Wprowadzić izofluran przez maskę na twarz i przewietrzyć przez wylot po drugiej stronie pudełka (mieszanina 0,8%-1,5% izofluranu/O2). Opcjonalnie użyj taśmy, aby przymocować korpus myszy.
nuta: W tym momencie można wstrzyknąć dożylnie znakowany fluorescencyjnie dekstran do wizualizacji naczyń krwionośnych lub inne barwniki.
- Opcjonalnie użyj pulsoksymetru i sondy grzewczej do monitorowania parametrów życiowych mięśnia.
nuta: W tym eksperymencie nie było konieczne użycie pulsoksymetru i sondy grzewczej, ponieważ mysz była stabilna przez cały okres obrazowania (2-3 godziny). Jednak w przypadku dłuższych czasów obrazowania może być konieczne dokładniejsze monitorowanie.
- Ustaw obiektyw wodny 25x (np. HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) w najniższym położeniu z i dodaj dużą kroplę wody.
nuta: Stosowanie mikrodozownika zanurzeniowego w wodzie jest wysoce zalecane w przypadku długotrwałych eksperymentów, ponieważ pozwala naukowcom na dodawanie wody podczas eksperymentu. Alternatywnie można użyć suchego obiektywu.
- Przenieść pudełko do obrazowania do mikroskopu wyposażonego w ciemną komorę klimatyczną o temperaturze 37 °C. Przyłóż obiektyw do szkiełka nakrywkowego CIW, aż dotknie go kropla wody.
- Korzystając z trybu epifluorescencji, obserwuj guz przez okular i ustaw ostrość komórek.
2. Akwizycja zdjęć poklatkowych
- Wybierz kilka interesujących pozycji do zobrazowania i zapisz ich współrzędne w oprogramowaniu. Upewnij się, że wybrane pozycje są reprezentatywnymi pozycjami z różnych miejsc guza (każdy guz może być inny, ale aby zapewnić spójność, wybierz tę samą liczbę pozycji, które są centralne dla rdzenia guza i krawędzi u wszystkich myszy).
nuta: Można wykonać skan płytki części guza lub całego widocznego guza; Jeśli jednak guz jest duży, ta metoda wydłuży czas poklatkowy między obrazami. Ponadto, jeśli komórki nowotworowe poruszają się szybko, śledzenie tych samych komórek w czasie może być trudne.
- Przełącz się w tryb wielofotonowy i dostrój laser do odpowiedniej długości fali. Należy pamiętać, że aby uniknąć fotouszkodzeń, pożądane są wyższe długości fal.
nuta: Do obrazowania Dendra2 użyto długości fali 960 nm. Przy celu zastosowanym w tych eksperymentach powiększenie 1,3 było wystarczające, aby uzyskać dobrą rozdzielczość jąder guza i zeskanować reprezentatywny obszar guza.
- Przejdź do trybu na żywo i zdefiniuj stos z dla każdej pozycji, aby uzyskać maksymalną objętość komórek nowotworowych bez uszczerbku dla rozdzielczości komórek nowotworowych. Określ rozmiar kroku między obrazami jako 3 μm.
- Użyj trybu dwukierunkowego, aby zwiększyć szybkość skanowania. Rozdzielczość obrazu powinna wynosić co najmniej 512 x 512 pikseli.
- Rób zdjęcia objętości guza w różnych pozycjach co 20 minut przez 2 godziny. Dodaj wodę do obiektywu przed każdym akwizycją obrazu.
nuta: Zdjęcia poklatkowe mogą być automatycznie pozyskiwane poprzez ustawienie odpowiedniego filmu poklatkowego w oprogramowaniu. Jednak mysz może się poruszać, a pozycja lub stos z mogą się zmieniać w czasie, powodując utratę danych. Dlatego zaleca się ręczne wykonanie time-lapse oraz sprawdzenie i dostosowanie do przesunięć xyz między przejęciami.
- Na tym etapie, opcjonalnie, należy dokonać fotoprzełącznika markera fluorescencyjnego Dendra2.
nuta: W przeciwieństwie do obrazowania poklatkowego (które pozwala na badanie właściwości poszczególnych komórek nowotworowych i ich zmian w czasie), pozwoli to na badanie obszaru naciekania komórek nowotworowych w mózgu przez kilka dni.