1. Test przyciągania makrofagów in vitro
- Przygotowanie kondycjonowanych pożywek
- Podgrzej pożywkę do konserwacji komórek nowotworowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Wyjmij roztwór do oddzielania komórek z lodówki. Spryskaj butelki z pożywką i roztworem do oddzielania komórek 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i przenieś je do kaptura do hodowli tkankowych.
- Wyjąć płytki 6-dołkowe z inkubatora. Ostrożnie odpipetować kondycjonowaną pożywkę do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Połóż rurki na lodzie. Odpipetować pożywkę znajdującą się w "samym pożywce" do oddzielnej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
UWAGA: Przed tym krokiem sprawdź pod mikroskopem, czy komórki się przyczepiają. Jeśli nie, można użyć powlekanych płytek, aby umożliwić lepsze mocowanie lub uwzględnić pływające komórki na etapie liczenia.
- Dodaj 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Sprawdź, czy komórki nowotworowe zaokrąglają się co minutę. Gdy komórki nowotworowe zaokrąglą się, delikatnie postukaj w bok płytki, aby pomóc komórkom się odłączyć.
- Odpipetować 2,5 ml pożywki do utrzymania komórek nowotworowych do studzienki, pipetować w górę iw dół 3 razy, aby wymieszać i przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
- Dostosuj objętość kondycjonowanej pożywki w zależności od liczby komórek, używając pożywki z komórkami macierzystymi wolnymi od surowicy (inkubacja w temperaturze 37 °C przez noc). Na przykład, jeśli studnia A ma 3 razy więcej żywych komórek niż studnia z najmniejszą liczbą komórek, rozcieńczyć jej kondycjonowane podłoże w stosunku 1:3. Ten krok służy do kontrolowania różnicy spowodowanej szybkością proliferacji komórek.
nuta: Powodem, dla którego zaleca się stosowanie pożywki z komórkami macierzystymi bez surowicy w inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc, jest kontrola możliwej zmiany w pożywce przy długotrwałej ekspozycji na 37 °C.
- Przefiltruj kondycjonowane media przez filtry 0,45 μm. Umieść kondycjonowane podłoże na lodzie.
UWAGA: Ten krok usuwa komórki i resztki komórek w kondycjonowanym pożywce.
2. Przygotowanie komórek MV-4-11
- Podgrzej pożywkę IMDM (bez FBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Spryskaj powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem i zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi. Spryskaj pożywkę butelką 70% etanolem, zetrzyj 70% etanolu z powierzchni ręcznikami papierowymi i włóż je do kaptura do hodowli tkankowej.
- Przenieść kolbę komórek MV-4-11 do okapu do hodowli tkankowej. Pobrać pipetą 10 ml komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl komórek i wymieszaj z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko liczące i określić ilościowo liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
- Przemyć komórki 10 ml PBS i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w pożywce IMDM (bez FBS), aby uzyskać końcową gęstość komórek 1x106 komórek/ml.
UWAGA: Liczbę komórek użytych tutaj makrofagów można dostosować.
3. Test Transwell
UWAGA: Do tego kroku użyj zestawu do testowania migracji komórek lub kup odczynniki i wstaw osobno. W przypadku ogniw MV-4-11 wybierz wkładki Transwell o wielkości porów 5 μm. Aby wykryć migrację makrofagów, należy bezpośrednio określić ilościowo liczbę makrofagów w dolnej komorze lub użyć metod kolorymetrycznych/fluorymetrycznych. Tutaj demonstrujemy test za pomocą metody kolorymetrycznej.
- Doprowadzić płytkę 24-dołkową, wkładkę i odczynniki do temperatury pokojowej.
- Do każdej wkładki dodać 250 μl przygotowanych powyżej komórek MV-4-11.
- Dodać 400 μl kondycjonowanej pożywki/samej pożywki (przy całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C, próbki te służą jako kontrola ujemna) do dolnych komór płytki 24-dołkowej. Dla każdej linii nowotworowej lub kontroli należy użyć trzech próbek. Unikaj pęcherzyków powietrza między wkładką a kondycjonowanym medium. Bąbelki będą hamować migrację makrofagów do studzienek dennych.
- Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny
UWAGA: Czas inkubacji można regulować. Komórki migrujące do dolnych komór można zobaczyć pod mikroskopem.
- Delikatnie postukaj wkładką w wewnętrzną ścianę tej samej studzienki i wyrzuć wkładkę. Ponieważ komórki MV-4-11 rosną w zawiesinie, roztwór do odrywania komórek lub leczenie trypsyną nie jest tutaj potrzebne.
- Delikatnie odpipetuj komórki w studzienkach 3 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieść 225 μl zawiesiny komórek na czarnościenną 96-dołkową płytkę odpowiednią do pomiaru fluorescencyjnego.
- Rozcieńczyć barwnik CyQuant w stosunku 1:75 z 4x buforem do lizy. Krótko odwiruj i odkręć roztwór. Dodać 75 μl roztworu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Odczyt fluorescencji za pomocą zestawu filtrów 480/520 nm z czytnikiem płytek fluorescencyjnych.
- Analizuj dane, odejmując ślepą próbę i normalizując do linii komórek kontrolnych nowotworu.
