Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Streszczenie

Źródło: Hurwitz, S. N. et al. Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Protokół

1. Dysocjacja tkanek i wirowanie różnicowe

1. Przygotować 10 ml buforu dysocjacyjnego (10 mg papainy; 5,5 mM L-cysteiny; 67 μM 2-merkaptoetanolu; 1,1 mM EDTA) w pożywce Hibernate-E na około 0,4–1,0 g tkanki.
   UWAGA: Wszystkie roztwory stosowane do wzbogacania i oczyszczania pojazdów elektrycznych należy rozcieńczyć w ultraczystej przefiltrowanej wodzie.
2. Dodać całą świeżą lub zamrożoną tkankę do buforu dysocjacyjnego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i inkubować w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 minut. W razie potrzeby tkankę można pociąć na mniejsze fragmenty przed inkubacją.
3. Po inkubacji dodać inhibitory proteazy i fosfatazy, aby uzyskać końcowe stężenie 1x do buforu dysocjacyjnego zawierającego tkankę.
4. Wlej roztwór zawierający tkankę do luźnego homogenizatora Dounce i delikatnie zdysocjuj tkankę, wykonując około 30 powolnych ruchów na próbkę. Liczba pociągnięć może być dostosowana w zależności od konsystencji tkanki.
5. Przenieść zdysocjowaną tkankę w buforze do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek i pozostałych włóknistych lub spoistych fragmentów tkanki.
6. Przenieść sklarowany osad do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia i odrzucenia dużych zanieczyszczeń komórkowych.
7. Przenieść supernatant ponownie do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia niepożądanych większych pęcherzyków lub małych ciał apoptotycznych.
   UWAGA: W razie potrzeby ten granulat można zachować do dodatkowych badań większych pęcherzyków.
8. Zdekantować supernatant przez filtr 0,45 μm do czystej probówki do ultrawirówki o pojemności 12 ml.
   nuta: Gęsto zwłókniałe próbki tkanek mogą nie być łatwe do przefiltrowania. Próbki te można przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm, a następnie przepuścić przez szeregowo mniejsze igły (18 G, 20 G, 22 G) przed przefiltrowaniem przez filtr 0,45 μm.
9. Ultraodwirować próbkę o masie 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek małych pojazdów elektrycznych.
10. Zdekantować supernatant i pozostawić probówki ultrawirówki odwrócone do góry dnem na 5–10 minut, często stukając w celu usunięcia resztek cieczy ze ścianek probówek. Pozostały płyn można również zassać za pomocą zasysającej pipety próżniowej.
11. Ponownie zawiesić granulat EV w 1,5 ml 0,25 M buforu sacharozy (10 mM Tris, pH 7,4). Ważne jest, aby na tym etapie zapewnić pełne ponowne zawieszenie pelletu. Aby to zrobić, przykryj rurki parafilmem przed wirowaniem EV do roztworu. Kołysz probówki ultrawirówki przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej przed ostatecznym wymieszaniem wirowym.
12. Krótko odwirować probówki z prędkością nie większą niż 1 000 x g, aby odzyskać płynną zawiesinę na dnie probówki.
13. Przejdź do poniższych etapów oczyszczania gradientu lub, jeśli to konieczne, przechowuj zawiesinę EV w temperaturze 4 °C przez noc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0,45 μm	Firma VWR	28145-505
Probówki ultrawirówkowe 12 ml	Beckman Coulter	331372
Probówki ultrawirówkowe 5,5 ml	Beckman Coulter	344057
Inhibitor fosfatazy HALT (100x roztwór)	ThermoFisher Naukowy	Numer telefonu 78420
Inhibitor proteazy HALT (100x roztwór)	ThermoFisher Naukowy	Numer telefonu 78438
Hibernacja E medium	ThermoFisher Naukowy	A1247601
Wirnik wahliwy MLS-50	Beckman Coulter	Numer telefonu 367280
Ultrawirówka stołowa Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315